SIRT1-PGC-1α對糖尿病小鼠足細(xì)胞線粒體氧化損傷與凋亡的影響及白藜蘆醇的干預(yù)研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)由于其高發(fā)率、高致殘率以及高死亡率，多年來一直是腎病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞在保持腎小球?yàn)V過屏障的完整性及預(yù)防蛋白尿的產(chǎn)生中具有重要作用，足細(xì)胞損傷可影響DN的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。足細(xì)胞是一種高度分化的終末細(xì)胞，再生能力差，其多級足突結(jié)構(gòu)功能的正常維持需要大量的能量消耗，對氧化應(yīng)激反應(yīng)相對敏感。正是這些特性導(dǎo)致了足細(xì)胞的易損。有研究報(bào)道，足細(xì)胞是DN最早受損細(xì)胞，在

2、DN早期即可出現(xiàn)凋亡、脫落，加重蛋白尿和腎小球硬化的進(jìn)程。
　　DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，既往大量研究表明，高糖可通過4條經(jīng)典生化途徑誘導(dǎo)腎臟損害，包括糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGE)增加，蛋白激酶C(PKC)激活，多元醇通路與已糖胺途徑的激活。但其之間的相互關(guān)系尚未明確。2001年，Brownlee教授首次提出了“統(tǒng)一機(jī)制理論”:認(rèn)為高糖誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過量活性氧(re

3、active oxygen species，ROS)是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的啟動因素。ROS的過度合成可激活上述途徑，進(jìn)一步促進(jìn)ROS的積聚，通過直接過氧化生物大分子和激活相關(guān)信號通路等方式，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和凋亡，造成糖尿病多器官并發(fā)癥的發(fā)生。通過多年的實(shí)驗(yàn)研究，這一統(tǒng)一理論已被多數(shù)學(xué)者認(rèn)可。由線粒體誘導(dǎo)的ROS可能在DN發(fā)病中發(fā)揮著起始和關(guān)鍵性作用。
　　線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS增多可將自身作為首要靶目標(biāo)導(dǎo)致線粒體損傷，包括對呼吸鏈及內(nèi)

4、外膜及基質(zhì)蛋白的影響，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生更多，ATP合成減少;進(jìn)而線粒體膜通透性改變，細(xì)胞色素C、AIF和Smac-DIABLO等一系列促凋亡因子外溢，啟動線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。由此可見，線粒體氧化損傷和誘發(fā)細(xì)胞凋亡可能是DN的重要致病機(jī)制，也有望成為DN治療的新靶點(diǎn)。
　　線粒體生物合成(Mitochondrial biogenesis)是維護(hù)和修復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)的生理活動，是介導(dǎo)核基因?qū)€粒體基因及蛋白表達(dá)調(diào)控的重要橋梁。

5、研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α是線粒體生物合成的中樞調(diào)節(jié)因子。其可促進(jìn)線粒體生物合成，增強(qiáng)不同組織細(xì)胞有氧呼吸功能。PGC-1α最初是作為核受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的轉(zhuǎn)錄輔激活因子被發(fā)現(xiàn)的，此后一系列的研究表明它在能量平衡、線粒體氧化代謝、熱量控制及糖、脂代謝中發(fā)揮重要作用。作為輔激活因子通過激活和并上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NRF1和TFAM的表達(dá)，對線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來，隨著研究的深入，在多種

6、糖尿病并發(fā)癥中發(fā)現(xiàn)了PGC-1α表達(dá)的下調(diào)，提示由其調(diào)控線粒體生物合成受損導(dǎo)致的線粒體功能障礙可能是糖尿病并發(fā)癥發(fā)病的重要機(jī)制之一。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α可被NAD+依賴性去乙?；赋聊畔⒄{(diào)節(jié)因子2(sir2)相關(guān)酶1(SIRT1)通過去乙酰化作用而激活。白藜蘆醇(resveratrol)是目前發(fā)現(xiàn)的SIRT1最強(qiáng)的激活劑。具有抗炎、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)糖脂代謝等重要生物學(xué)功效。多數(shù)研究認(rèn)為，其藥理作用的發(fā)揮有賴于SIRT1的

7、激活。近來，白藜蘆醇在腎臟疾病治療中的作用也越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。在DN動物模型中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有降低蛋白尿;減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等眾多腎臟保護(hù)作用。在心肌和骨骼肌的研究中，有學(xué)者指出，白藜蘆醇可通過激活SIRT1進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游基因PGC-1α和FOXO來改善線粒體功能。糖尿病腎病時(shí)，白藜蘆醇的腎臟保護(hù)作用是否也與其激活SIRT1/PGC-1α通路改善線粒體功能，進(jìn)而減少氧化應(yīng)激和凋亡有關(guān)尚需進(jìn)一步研究證

8、實(shí)。
　　本研究通過建立1型糖尿病小鼠模型和高糖刺激體外培養(yǎng)足細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用白藜蘆醇以及PGC-1αsiRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)干預(yù)，深入探討線粒體氧化損傷和凋亡在糖尿病足細(xì)胞病變中的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明DN的發(fā)病機(jī)制及其早期防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.SIRT1/PGC-1α在糖尿病小鼠腎組織的表達(dá)及白藜蘆醇對其的干預(yù)研究將健康雄性CD-1小鼠（4-6周）隨機(jī)分為3組:正常對照組(normalcontrol

9、group NC組)、糖尿病組(diabetic group DM組)、糖尿病+白藜蘆醇干預(yù)組（diabetic+Resveratrol group DR組）。應(yīng)用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，140 mg/kg)法制備糖尿病小鼠模型，72小時(shí)后檢測尾尖血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++～++++確定為糖尿病模型制備成功。DR組給予白藜蘆醇30mg·kg-1·d-1灌胃，每日一次，NC組與DM組僅給

10、予等量溶劑（羧甲基纖維素）灌胃。分別于成模后4、8、12周留取各組小鼠血液及24小時(shí)尿液標(biāo)本，用于血糖(blood glucose，BG)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)和尿蛋白定量(urinary protein，UP)的檢測。切取部分腎皮質(zhì)組織于4％中性甲醛固定制備石蠟切片用于PAS、HE病理染色，TUNEL染色以及SIRT1、PGC-1α、NRF

11、1和TFAM免疫組織化學(xué)染色;部分腎皮質(zhì)組織于4％戊二醛固定后用于電鏡觀察;部分腎皮質(zhì)用于提取總蛋白行Western blot檢測SIRT1、PGC-1α、 NRF1、TFAM和Nephrin，cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)，比色法檢測腎皮質(zhì)MDA含量和Mn-SOD活力變化。
　　2.高糖對足細(xì)胞SIRT1/PGC-1α表達(dá)及線粒體氧化損傷與凋亡的影響條件性永生化小鼠足細(xì)胞在33℃，含有γ-IFN(10U/ml)及1

12、0％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)傳代后，置于37℃，不含γ-IFN的RPMI1640培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)10-14天，待足細(xì)胞分化成熟后開始后續(xù)試驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常糖組（5.5 mmol/L glucose，NG）、高滲對照組(24.5 mmol/L mannitol，MG)和高糖組(30 mmol/L glucose，HG)。同步化后分組干預(yù)，刺激0、12、24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測SI

13、RT1、PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表達(dá);Real-timePCR檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA表達(dá);提取細(xì)胞總蛋白行Western blot檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM和Nephrin，cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá);提取去線粒體胞漿蛋白行western blot檢測Cyto C和DIABLO的表達(dá);JC-1染色檢測活細(xì)胞線粒體膜電位的變化;DCHF-DA染色檢測細(xì)胞

14、內(nèi)總ROS含量;MitoSOX染色檢測線粒體ROS的含量;比色法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ的活性變化。AnnexinⅤ/PI染色檢測足細(xì)胞凋亡率。
　　3.白藜蘆醇及PGC-1αsiRNA對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞線粒體氧化損傷與凋亡的影響將分化成熟的足細(xì)胞隨機(jī)分為6組:正常糖組(5.5 mmol/L glucose，NG組)，高糖組（glucose30 mmol/L，HG組），高糖+白藜蘆醇干預(yù)組(glucose30 mmol/L+re

15、sveratrol10μmol/L,HG+Res組)，高糖+EX527干預(yù)組（glucose30 mmol/L+EX52710μmol/L，HG+EX527組），高糖+PGC1 siRNA干預(yù)組(glucose30 mmol/L+PGC1 siRNA,HG+PGC1 siRNA組)和高糖+PGC1 siRNA+白藜蘆醇干預(yù)組(glucose30 mmol/L+PGC1siRNA+resveratrol10μmol/L，HG+PGC1 s

16、iRNA+Res組)，各組同步化后干預(yù)48h收集細(xì)胞，Real-time PCR檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAMmRNA表達(dá);提取細(xì)胞總蛋白行Western blot檢測SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM和Nephrin，cleaved caspase-3的蛋白表達(dá);提取去線粒體胞漿蛋白行western blot檢測Cyto C和DIABLO的表達(dá);JC-1染色檢測活細(xì)胞線粒體膜電位的變化;DCHF-DA染色檢

17、測細(xì)胞內(nèi)總ROS含量;MitoSOX染色檢測線粒體ROS的含量;比色法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ的活性變化。AnnexinⅤ/PI染色檢測足細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.SIRT1/PGC-1α在糖尿病小鼠腎組織的表達(dá)及白藜蘆醇對其的干預(yù)研究①生化結(jié)果顯示:4周時(shí)，DM組小鼠尿蛋白較NC組升高，且隨病程延長呈上升趨勢;8周時(shí)，DM組BUN和TC水平升高，12周時(shí)升高更加顯著。DR組小鼠蛋白尿水平較同時(shí)期DM組降低;12

18、周時(shí)，DR組TC和BUN水平均較DM組改善。②光鏡下觀察:DM組小鼠4周時(shí)出現(xiàn)腎小球直徑增大，系膜區(qū)基質(zhì)增多;8周時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性;12周時(shí)，腎小球內(nèi)系膜區(qū)增寬更為顯著，并可見腎間質(zhì)水腫，部分腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞脫落再生。③電鏡下觀察，12周時(shí)DM組小鼠腎小球基底膜明顯不均勻增厚，足突廣泛融合，裂孔隔膜消失，足細(xì)胞線粒體數(shù)量減少，并出現(xiàn)腫脹、空泡變、內(nèi)部膜及嵴結(jié)構(gòu)紊亂消失等病理改變;DR組上述病變均有所改善。④比色法

19、檢測結(jié)果顯示，DM組小鼠腎皮質(zhì)MDA含量較NC組明顯升高，且隨病程延長呈上升趨勢，而Mn-SOD活性則較同時(shí)期NC組降低，12周時(shí)，降低最為明顯。DR組較同時(shí)期DM組有所改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤TUNEL染色結(jié)果顯示:8周時(shí)，DM組小鼠腎小球及腎小管間質(zhì)中均可見凋亡細(xì)胞，12周時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)量較NC組明顯增多。DR組凋亡現(xiàn)象較DM組有所減輕。⑥免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM在NC組腎小球固有細(xì)胞及腎

20、小管上皮細(xì)胞中均可見陽性表達(dá)。其中SIRT1、NRF1主要表達(dá)于胞核;PGC-1α在胞核和胞漿中均有表達(dá)，以胞漿表達(dá)更為明顯;TFAM則主要表達(dá)于胞漿中。8周時(shí)，DM組上述指標(biāo)的陽性表達(dá)較NC組減少，12周時(shí)，減少更為顯著。⑦Western blot結(jié)果顯示:DM組腎皮質(zhì)SIRT1蛋白表達(dá)在4周時(shí)已較正常組減低，隨病程延長，下降更為顯著。而PGC-1α、NRF1和TFAM的表達(dá)在8周時(shí)表達(dá)下調(diào)，12周時(shí)下調(diào)更加明顯。DR組上述4種蛋白表

21、達(dá)均較DM組增多，但仍低于同時(shí)期NC組。12周時(shí)，DM組小鼠腎皮質(zhì)Nephrin表達(dá)較NC組明顯減低，cleavedcaspase3表達(dá)較NC組明顯升高，DR組上述兩指標(biāo)均較DM組改善。
　　2.高糖對足細(xì)胞SIRT1/PGC-1α表達(dá)及線粒體氧化損傷與凋亡的影響①免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM在NG組均可見陽性表達(dá)，SIRT1、NRF1主要表達(dá)于細(xì)胞核;PGC-1α胞漿、胞核均有陽性表達(dá)，以胞

22、漿表達(dá)更為明顯;TFAM主要表達(dá)于胞漿中。HG組上述蛋白均較NG組陽性表達(dá)減少。②Western blot顯示，高糖干預(yù)12h，SIRT1表達(dá)較0h降低，隨干預(yù)時(shí)間延長，表達(dá)呈遞減趨勢;PGC-1α表達(dá)在12h略有增加，NRF1和TFAM則較0h無明顯變化，三者均從高糖干預(yù)24h開始，呈時(shí)間依賴性遞減，72h降低最為顯著。③real time PCR結(jié)果顯示，高糖刺激呈時(shí)間依賴性引起SIRT1 mRNA表達(dá)降低，以48h減低最顯著。PG

23、C-1α、NRF1、TFAM mRNA減低發(fā)生在高糖刺激24h，此后隨干預(yù)時(shí)間延長表達(dá)逐漸下調(diào)。④Western blot結(jié)果顯示，高糖干預(yù)下，足細(xì)胞Nephrin蛋白呈時(shí)間依賴性下調(diào)，cleaved caspase3則呈逐漸上調(diào)趨勢。去除線粒體的胞質(zhì)蛋白中Cyto C和Diablo蛋白也隨高糖干預(yù)時(shí)間延長表達(dá)升高。⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，高糖干預(yù)12h，細(xì)胞內(nèi)總ROS含量較0h升高，且隨時(shí)間延長呈遞增趨勢。⑥熒光顯微鏡下顯示，高糖干

24、預(yù)12h時(shí)，足細(xì)胞線粒體中ROS含量較未干預(yù)時(shí)明顯增多，且隨干預(yù)時(shí)間延長熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。⑦比色法結(jié)果顯示，高糖干預(yù)24h，足細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性下降，48h、72h降低更為明顯，⑧足細(xì)胞線粒體膜電位隨高糖干預(yù)時(shí)間延長呈降低趨勢，共聚焦顯微鏡下可見由紅色熒光向綠色熒光的轉(zhuǎn)變過程。⑨流式細(xì)胞儀檢測顯示，足細(xì)胞凋亡率隨高糖干預(yù)時(shí)間延長逐漸上調(diào)。
　　3.白藜蘆醇及PGC-1α siRNA對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞線粒體氧化損傷與凋亡

25、的影響①Western blot與Real time PCR檢測結(jié)果顯示，干預(yù)48h，HG組SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白及mRNA表達(dá)量均較NG組明顯降低，HG+Res組上述4種蛋白及mRNA表達(dá)較HG組升高，而HG+EX527組則均較HG組進(jìn)一步降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②Western blot檢測結(jié)果顯示，干預(yù)48h，HG組Nephrin蛋白表達(dá)量較NG組降低，HG+EX527組降低更加顯著;HG+Res組其表達(dá)

26、量較HG組升高。HG組cleaved caspase3的表達(dá)較NG組升高，HG+EX527組上升更為顯著;HG+Res組其表達(dá)量較HG組降低。去線粒體胞質(zhì)蛋白中Cyto C、DIABLO的表達(dá)在HG組也較NG組明顯升高，HG+Res組其表達(dá)量較HG組有所降低，HG+EX527組升高較HG組更為明顯。③HG+PGC1 siRNA組SIRT1表達(dá)較HG組無明顯變化，HG+PGC1 siRNA+Res組SIRT1表達(dá)較HG組升高，與HG+Re

27、s組表達(dá)無明顯差異。HG+PGC1 siRNA組PGC-1α、NRF1和TFAM表達(dá)均較HG組明顯降低，HG+PGC1 siRNA+Res組上述3種蛋白較HG+Res組表達(dá)降低，同HG+PGC1 siRNA組無明顯差異。④HG+PGC siRNA組Nephrin表達(dá)較HG組進(jìn)一步減低，HG+PGC siRNA+Res組表達(dá)低于HG+Res組。HG+PGC1 siRNA組cleaved caspase3與HG組相比表達(dá)升高，HG+PGC1

28、 siRNA+Res組表達(dá)量高于HG+Res組。⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，干預(yù)48h，HG+Res組線粒體內(nèi)ROS合成量較HG組明顯降低，而HG+EX527組較HG組進(jìn)一步升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑥HG+Res組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性及線粒體膜電位均較HG組有所上升，而HG+EX527組較HG組減低更加顯著。⑦HG組足細(xì)胞內(nèi)總ROS含量較NG組明顯升高，HG+EX527組升高更加明顯，HG+Res組足細(xì)胞內(nèi)總ROS含量較HG組明

29、顯降低。HG+PGC1 siRNA組則較HG組含量更高，HG+PGC1 siRNA+Res組較HG+PGC1 siRNA組有所降低，但明顯高于HG+Res組。⑧HG組足細(xì)胞凋亡率明顯高于NG組，HG+EX527組較HG組升高更加顯著，HG+Res組與HG組比較，凋亡率明顯降低。HG+PGC1siRNA組凋亡率高于HG組，HG+PGC1 siRNA+Res組較HG+PGC1 siRNA組有所降低，但明顯高于HG+Res組。
　　結(jié)論

30、:
　　1.糖尿病小鼠腎組織、高糖培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞均出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率升高;并伴有腎組織與足細(xì)胞內(nèi)SIRT1、PGC-1α的表達(dá)下調(diào)。
　　2.糖尿病小鼠腎小球足細(xì)胞出現(xiàn)線粒體形態(tài)異常，裂孔隔膜消失，足突融合，凋亡等病理改變，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS合成增多，呼吸鏈復(fù)合物活性下降，線粒體膜電位降低，線粒體凋亡途徑被激活。提示線粒體功能障礙參與了糖尿病足細(xì)胞的氧化損傷與凋亡。
　　3.白藜蘆醇可上調(diào)糖尿

31、病小鼠腎組織SIRT1、PGC-1α表達(dá)，改善糖尿病小鼠足細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常及足突融合，上調(diào)裂孔隔膜蛋白nephrin的表達(dá)，減少足細(xì)胞凋亡的發(fā)生。其減少尿蛋白的機(jī)制可能與足細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。
　　4.白藜蘆醇可上調(diào)高糖環(huán)境中足細(xì)胞SIRT1、PGC-1α及其下游基因的表達(dá);減少高糖環(huán)境下足細(xì)胞線粒體ROS合成增多，改善呼吸鏈復(fù)合物活性，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡通路的激活。
　　5.白藜蘆醇可能通過SIRT1/