腹瀉患者和生態(tài)環(huán)境香港海鷗菌的檢測及多位點(diǎn)序列分型研究.pdf

1、研究目的：
　　1.收集廣州市醫(yī)院門診腹瀉病例的糞便標(biāo)本進(jìn)行香港海鷗菌檢測并收集相關(guān)信息，計算發(fā)病率以了解廣州地區(qū)香港海鷗菌所致腹瀉的發(fā)病狀況，并探索危險因素;
　　2.采集廣州市的淡水魚、食用蛙、食用螺（中華圓田螺、福壽螺）進(jìn)行香港海鷗菌檢測，收集陽性菌株，以了解目前廣州市淡水產(chǎn)品中香港海鷗菌的感染情況及各宿主之間聯(lián)系;
　　3.檢測廣州市環(huán)境水體中香港海鷗菌以探索其攜帶狀況;
　　4.為深入闡明LH的耐藥性及

2、分子遺傳特征，進(jìn)行以下研究:分析LH分離株抗生素耐藥表型;運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技術(shù)對不同宿主來源的LH分離株進(jìn)行分型分析，評價菌株間的遺傳親緣關(guān)系。
　　研究方法：
　　1.廣州市某綜合醫(yī)院門診腹瀉病人糞便標(biāo)本、廣州市農(nóng)貿(mào)市場淡水產(chǎn)品（淡水魚、食用蛙、福壽螺）及水庫水樣中香港海鷗菌檢出情況的調(diào)查研究
　　1.1 標(biāo)本收集和資料獲取:
　　2013年5

3、月至2014年11月收集醫(yī)院感染疾病科門診，消化科門診和急診科胃腸炎腹瀉患者的糞便標(biāo)本;病人的一般情況、臨床表現(xiàn)及流行病學(xué)資料通過自制的《感染性腹瀉調(diào)查表》獲得;
　　2013年12月至2014年5月選擇廣州市4家農(nóng)貿(mào)市場，采集淡水產(chǎn)品，包括草魚、虎紋蛙、中華圓田螺，所采樣品單獨(dú)采集后室溫狀態(tài)即時送實(shí)驗(yàn)室檢測。
　　在廣州市內(nèi)各區(qū)（白云區(qū)、天河區(qū)、黃浦區(qū)、花都區(qū)、番禺區(qū)、蘿崗區(qū)）分別選擇一個水庫（和龍水庫、新塘水庫、黃埔水庫

4、、金鐘水庫、渾坑水庫、新陂水庫）共6個水庫進(jìn)行采樣，所取水樣按無菌原則采集后立即送檢。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測:
　　1.2.1 香港海鷗菌培養(yǎng)及生化鑒定
　　收集到的腹瀉病人標(biāo)本所采集糞便標(biāo)本立即放入Cary-blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基，48h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，糞便標(biāo)本直接劃線改良頭孢哌酮酮MacConkey瓊脂(CMA)平皿，頭孢哌酮濃度為16mg/L，CMA培養(yǎng)皿置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，試驗(yàn)均以H

5、KU1菌株（香港大學(xué)微生物學(xué)系袁國勇教授惠贈）作為陽性對照菌株?？梢杉?xì)菌進(jìn)行革蘭染色、過氧化氫酶、氧化酶、脲酶和三糖鐵等關(guān)鍵生化試驗(yàn)篩選，以上均符合者再采用API鑒定。
　　淡水產(chǎn)品標(biāo)本在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)相應(yīng)處理后得到的腸道棉拭子接種LH選擇性培養(yǎng)基，及改良頭孢哌酮MacConkey瓊脂(CMA)平皿，后檢測步驟同上。
　　水庫水樣采集需在24h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，采用濾膜法進(jìn)行加壓過濾，然后將濾膜置于改良頭孢哌酮MacConk

6、ey瓊脂(CMA)平皿進(jìn)行培養(yǎng)，后檢測步驟同上。
　　1.2.2 香港海鷗菌基因鑒定
　　1.2.2.1 特異性片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
　　擴(kuò)增目的片段是香港海鷗菌16S rRNA基因特異性序列，上游序列為:5'-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3'，下游序列為:5'-TCTCTTCGAGGTTCGGTA-3'，擴(kuò)增片段大小為550bp。反應(yīng)體系:總體積:50μL，其中10xPCR緩沖液5μL，25mmo

7、l/L MgCl24μL，2.5 mmol/L dNTPs4μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL，0.6mmol/L引物各1μL，模版DNA5μL，雙蒸水29.75μL。反應(yīng)條件為94.0℃5min，94.0℃30S，53.0℃40S，72.0℃40S，35個循環(huán)，72.0℃5min。用DL2000作為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Marker，以LH人源株(HKUI，香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系袁國勇教授惠贈)為陽性對照，以大腸桿菌ATCC

8、25922為陰性對照。
　　1.2.2.2 16S rRNA PCR擴(kuò)增與測序
　　方法同上，引物設(shè)計參照文獻(xiàn)[1]，擴(kuò)增16S rRNA基因序列，序列為:LPW264:5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3',LPW265:5'-GNTACCTTGTTACGACTT-3'，長度為1495bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行序列測定。
　　2.紙片擴(kuò)散法確定LH人源分離株的抗生素敏感性
　　采用WHO

9、推薦的K-B紙片擴(kuò)散法測，判定標(biāo)準(zhǔn)按美國CLSI/NCCLSM100-519抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(2009版)腸桿菌科抑制圈直徑的解釋標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。敏感(susceptible，s)率、中介(intermediate，I)率、耐藥(resistant，R)率分別用S％、I％、R％表示。并用大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923作質(zhì)控。
　　研究結(jié)果：
　　1.廣州市人群現(xiàn)場LH研究
　　于2

10、013年5月-2014年11月采集廣州市某綜合醫(yī)院門診腹瀉患者545例（編號:1004-1548）糞便進(jìn)行香港海鷗菌的檢測，目前未發(fā)現(xiàn)香港海鷗菌感染陽性病例。
　　2.廣州市部分淡水產(chǎn)品LH檢測結(jié)果
　　324份淡水產(chǎn)品中共檢出香港海鷗菌53株，陽性率為16.36％(53/324)，其中草魚256份，香港海鷗菌在草魚的陽性率為17.97％(46/256)，15只虎紋蛙中檢出7只陽性，陽性率為46.67％。中華圓田螺53份，未

11、檢出LH。
　　3.廣州市各區(qū)水庫水樣LH檢測結(jié)果
　　于白云區(qū)和龍水庫的水樣培養(yǎng)分離出香港海鷗菌，經(jīng)過生化鑒定及16SrRNA基因序列測定，并與GenBank中登錄的香港海鷗菌(菌株號HKUI)進(jìn)行序列比對，其同源性均為99％，這是目前廣東省廣州市水庫中首次發(fā)現(xiàn)香港海鷗菌。
　　水庫分離株菌落形態(tài):CMA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48h后，菌落呈灰白色、半透明、圓形、略凸起、直徑在1.0-1.5mm之間、光滑、不粘連，略顯濕潤

12、，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性，形狀呈螺旋桿狀或展翅海鷗形狀。
　　水庫分離株的生化檢測結(jié)果:均為革蘭氏陰性菌，氧化酶、過氧化氫酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原酶、甘露醇、葡糖酸鹽、癸酸鹽等陽性，三糖鐵、鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、硫化氫、吲哚、3-羥基丁酮、明膠酶、β-半乳糖苷酶、纖維糖、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、葡萄糖等陰性。
　　4.廣州市分離株藥敏結(jié)果
　　54株LH分離

13、株對10個種類常用抗生素中的19種藥物均表現(xiàn)不同程度的耐藥性。耐藥率從高到低依次如下:頭孢哌酮(53/54，98.15％)，頭孢唑啉(52/54，96.30％)，頭孢噻吩(51/54，94.44％)，氨芐西林(44/54，81.48％)，利福平(38/54，70.37％)，紅霉素(15/54，27.78％)，哌拉西林(11/54，20.37％)，四環(huán)素(10/54，18.52％)，頭孢他啶(8/54，14.81％)，環(huán)丙沙星(7/54，

14、12.96％)，頭孢吡肟(6/54，11.11％)，氨曲南(5/54，9.26％)，鏈霉素(4/54，7.41％)，頭孢呋辛(4/54，7.41％)，復(fù)方新諾明(3/54，5.56％)，氯霉素(2/54，3.70％)，亞胺培南(1/54，1.85％)，阿米卡星(1/54，1.85％)，慶大霉素(0/54，0％)。各種分離株均發(fā)現(xiàn)對頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)耐藥，大多數(shù)對第一、三代頭孢菌素表現(xiàn)耐藥，而對第二、四代頭孢菌素表現(xiàn)較低的耐藥性。大多數(shù)

15、分離株對利福平表現(xiàn)耐藥。
　　研究結(jié)論：
　　1.本次研究對廣州市某綜合醫(yī)院545例門診腹瀉患者糞便進(jìn)行香港海鷗菌的檢測，目前未發(fā)現(xiàn)香港海鷗菌感染陽性病例。324份淡水產(chǎn)品中共檢出香港海鷗菌53株，其中香港海鷗菌在草魚的陽性率為17.97％，虎紋蛙中陽性率為46.67％。中華圓田螺中未檢出。本研究在廣州市水庫水樣中分離出香港海鷗菌，證明了在天然水環(huán)境中存在香港海鷗菌。因此，攜帶香港海鷗菌的水庫水可能為香港海鷗菌的感染渠道。同

16、時，水庫是淡水魚類等淡水產(chǎn)品的常見生活環(huán)境，因而作為香港海鷗菌傳播途徑的環(huán)境媒介，對香港海鷗菌的流行具有重要意義。
　　2.各種分離株均發(fā)現(xiàn)對頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)耐藥，大多數(shù)對第一、三代頭孢菌素表現(xiàn)耐藥，而對第二、四代頭孢菌素表現(xiàn)較低的耐藥性。大多數(shù)分離株對利福平表現(xiàn)耐藥。大多數(shù)分離株對亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星等藥物較敏感。
　　3.本研究所采用的MLST研究方案為選取rho、ancB、ftsH、trpE、ilvC、th