Rad1抗體的制備與ccFv抗體展示系統(tǒng).pdf

1、目的：1、使用雜交瘤技術(shù)制備小鼠DNA損傷響應(yīng)蛋白Rad1（mRad1）抗體；利用該抗體研究Rad1的定位及DNA損傷壓力下Rad1的行為。2、用卷曲螺旋異源二聚體（ccFv）形式將抗體可變區(qū)展示在細(xì)菌內(nèi)膜表面，構(gòu)建大容量抗體突變庫，利用流式精確分選對已獲得的抗體進(jìn)行親和力成熟，為抗體的人工進(jìn)化提供技術(shù)平臺。
　　方法：1、PCR擴(kuò)增小鼠Rad1并構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1上，利用GST層析柱純化mRad1蛋白，并用其免

2、疫BABL/c小鼠，使用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附、蛋白質(zhì)印跡、免疫共沉淀和免疫熒光方法檢測抗體應(yīng)用性，生物大分子相互作用Surface Plasmon Resonace(SPR)測定抗體親和力；用自制抗體通過蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測Rad1在DNA合成抑制劑hydroxyurea(HU)作用下的表達(dá)情況。易錯PCR突變抗體庫的構(gòu)建，在細(xì)菌內(nèi)膜上表達(dá)并展示抗體，流式細(xì)胞術(shù)分析分選，PCR回收優(yōu)勢抗體基因，抗體突變株的

3、測序、篩選及表達(dá)，SPR測定抗體親和力。
　　結(jié)果：1、通過優(yōu)化的雜交瘤技術(shù)成功獲得了高質(zhì)量的小鼠Rad1單克隆抗體F10，多種生化手段顯示該抗體遠(yuǎn)優(yōu)于商業(yè)來源抗體；利用該單抗發(fā)現(xiàn)：Rad1的表達(dá)受另一個DNA損傷響應(yīng)蛋白Rad9的調(diào)控。2、成功的構(gòu)建了抗TNFα的抗體大容量ccFv形式的細(xì)菌展示抗體庫，利用該系統(tǒng)提高了抗體的親和力，成功的將 Rad1抗體基因展示于細(xì)菌內(nèi)膜表面。
　　結(jié)論：1、提高抗原純度和增加免疫動物時間