不同生長(zhǎng)因子對(duì)牛體外受精胚胎的發(fā)育及胚胎干細(xì)胞系的建立的影響.pdf

1、哺乳動(dòng)物卵子及早期胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)的興起，為卵母細(xì)胞體外成熟、體外胚胎發(fā)育、母源基因向合子基因調(diào)控的轉(zhuǎn)換、個(gè)體發(fā)育啟動(dòng)（信息、物質(zhì)、能量）機(jī)制研究、孵化囊胚植入等諸多科學(xué)問題的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)和保障。目前小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的卵子及早期胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)越來越成熟，與此同時(shí)，科研工作者們?cè)谂！⒀?、豬、馬等家畜中進(jìn)行了大量的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。本研究中，首先以牛卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精技術(shù)為基礎(chǔ)，在牛卵母細(xì)胞體外受精后48小時(shí)向牛的合成輸卵管液(S

2、ynthetic Oviduct Fluid:SOF)中添加Y27632，2i/lif和透明質(zhì)酸酶，分別調(diào)控Rock、Wnt、MEK/ERK、LIF/Stat和CD44/MAPK信號(hào)通路。通過統(tǒng)計(jì)體外胚胎的卵裂率和囊胚率，揭示不同培養(yǎng)條件對(duì)牛早期胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果顯示:10μM Y27632培養(yǎng)條件下第七天囊胚發(fā)育率較高;同時(shí)，對(duì)體外受精獲得的囊胚進(jìn)行免疫熒光染色，比較囊胚期胚胎的總細(xì)胞數(shù)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass:I

3、CM)細(xì)胞數(shù)和滋養(yǎng)層(Trophectoderm:TE)細(xì)胞數(shù)，探討調(diào)控不同信號(hào)通路對(duì)牛早期胚胎發(fā)育中細(xì)胞分化命運(yùn)決定的影響，結(jié)果顯示:添加Y27632培養(yǎng)條件下的囊胚TE細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組SOF中的囊胚TE細(xì)胞數(shù)，表明Y27632促進(jìn)牛滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖;此外，我們將發(fā)育液中Y27632的濃度設(shè)置10μM，50μM和1OOμM三種不同濃度梯度，研究不同濃度梯度的Y27632對(duì)牛早期胚胎發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示:在濃度為10μM Y276

4、32培養(yǎng)條件下，體外受精囊胚的發(fā)育率顯著升高，表明牛體外受精胚胎發(fā)育受Y27632的濃度影響。另外，添加2i/lif和透明質(zhì)酸酶組中的胚胎與對(duì)照組中的胚胎相比，囊胚率、胚胎總細(xì)胞數(shù)、TE細(xì)胞數(shù)和ICM細(xì)胞數(shù)均無明顯差異;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源添加2i/lif和透明質(zhì)酸酶對(duì)牛早期胚胎體外發(fā)育無顯著影響。
　　近年，科研工作者對(duì)大鼠、倉鼠、水貂、綿羊、兔、豬、牛等動(dòng)物開展了建立胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells:ESCs

5、)的大量研究，但除了小鼠的ESCs細(xì)胞以外，其他動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞在形態(tài)和多能性方面都與小鼠ESCs有很大的區(qū)別，被稱為類胚胎干細(xì)胞。在本研究中，利用上述牛體外受精胚胎，使用添加AFR(Activin A，bFGF，KSR)、AFY(Activin A，bFGF，Y27632)的培養(yǎng)基以及人和豬的ESCs培養(yǎng)體系，建立牛ESCs細(xì)胞系。接種96枚胚胎，其中19枚胚胎形成outgrow（貼壁生長(zhǎng)），AFY培養(yǎng)體系經(jīng)機(jī)械傳代后能傳到第四代。堿