自由清醒小鼠軀體運動及排尿行為相關(guān)的皮層神經(jīng)元集群鈣信號研究.pdf

1、運動是機體一項復雜的行為活動，需要多個腦區(qū)共同參與。其中，運動皮層是運動控制的高級中樞，在運動的準備和執(zhí)行等環(huán)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。初級運動皮層(M1)是運動皮層的核心區(qū)域，其內(nèi)第5層椎體神經(jīng)元與脊髓存在大量的神經(jīng)聯(lián)系，可以直接向脊髓下達運動指令并控制運動的執(zhí)行。視覺皮層是調(diào)控機體運動行為的另一個重要腦區(qū)，與運動皮層有著大量的神經(jīng)聯(lián)系。其中的初級視覺皮層(V1)接受來自外界環(huán)境的視覺輸入，對個體的自身定位和運動行為的指引有重要意義。然而

2、目前，兩個皮層在運動過程中對信息處理和編碼的機制仍不清楚。
　　排尿行為不僅是人和動物的一項基本生理功能，也是一項復雜社會行為，它涉及膀胱的兩個過程:儲存和排空。排尿反射是膀胱的排空過程中的關(guān)鍵關(guān)節(jié)，需要神經(jīng)系統(tǒng)中的多個區(qū)域的共同調(diào)控。排尿反射是一條由脊髓-延髓-脊髓介導的神經(jīng)環(huán)路，環(huán)路上有一個關(guān)鍵性的腦區(qū)腦橋排尿中樞(PMC)。腦橋排尿中樞是目前研究明確所知的控制排尿的中樞區(qū)域。它的激活會引起尿道膀胱逼尿肌收縮、平滑肌的松弛進而

3、使尿液流出膀胱。但是，排尿行為作為一種高度可控的行為，還應該受到更高級中樞的控制，如大腦皮層。但目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)有確切控制排尿功能的皮層區(qū)域。
　　傳統(tǒng)的用于研究皮層信息編碼和處理的方法是監(jiān)測單個神經(jīng)元的活動。然而，長期以來，研究神經(jīng)元集群的活動是另一種解析皮層的工作模式的重要方式。大量研究已經(jīng)證明，集群的神經(jīng)元活動參與腦的多種功能并扮演重要角色，如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、感覺信息處理以及學習和記憶等。常用的監(jiān)測腦集群神經(jīng)活動的方法有局部

4、場電位、功能磁共振和雙光子鈣成像等。但以上方法存在空間分別率不足、成像深度過淺或者不能在自由清醒動物身上記錄等限制。近幾年，一種名為光纖記錄的集群鈣信號記錄方法得到了快速發(fā)展和應用。它是一種操作方便、高效、可用于自由運動動物深部腦區(qū)記錄的鈣信號監(jiān)測方法。
　　綜合以上信息，在本文中我們采用光纖記錄的方法，監(jiān)測運動和排尿行為過程中動物大腦皮層集群神經(jīng)元的鈣活動情況，試圖解析皮層在運動和排尿過程中信息處理和編碼的神經(jīng)機制。
　　

5、本文主要發(fā)現(xiàn)如下:
　　1.不同麻醉深度對小鼠大腦皮層集群鈣信號的影響。
　　麻醉對大腦活動狀態(tài)的影響涉及多個層次，小至單個神經(jīng)元大到全腦水平，但麻醉對小規(guī)模局部神經(jīng)元集群的影響仍所知甚少。因此，在本文中我們選取初級運動皮層(M1)和初級視覺皮層(V1)作為研究區(qū)域。我們在M1區(qū)或V1區(qū)第5層注射鈣染料OGB-1AM，并用光纖記錄注射區(qū)域的鈣信號變化。在M1區(qū)，我們分別在5個不同的麻醉深度(2％，1.5％，1.2％，1％，0

6、.8％)下進行了鈣信號記錄，而在V1區(qū)，我們僅在0.8％深度下進行了記錄。
　　(1)不同麻醉深度對皮層集群鈣信號頻率特征的影響。
　　隨著麻醉濃度的降低，M1區(qū)的鈣信號的發(fā)放頻率逐漸升高，從2％的0.044±0.013Hz升高到0.8％的0.477±0.0026Hz，而且相鄰兩種麻醉深度下的鈣信號頻率有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。相同麻醉深度下，M1區(qū)與V1區(qū)的鈣信號頻率沒有顯著差別(p=0.051)。
　　(2)不

7、同麻醉深度對皮層集群鈣信號幅度特征的影響。
　　不同麻醉深度對鈣信號幅度的影響則與頻率相反。隨著麻醉濃度的降低，M1區(qū)的鈣信號幅度也隨之降低，從2％的0.052±0.012ΔF/F降低到0.8％的0.016±0.009ΔF/F（ΔF/F代表熒光強度變化），而且相鄰兩種麻醉深度下的鈣信號幅度有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。同樣的，M1區(qū)與V1區(qū)的鈣信號幅度在相同麻醉深度下沒有差別(p=0.883)。
　　(3)不同麻醉深度對皮層

8、集群鈣信號上升時間的影響。
　　鈣信號的上升時間非常穩(wěn)定，既不會被麻醉的變化所影響，也不會受到不同腦區(qū)的影響。具體結(jié)果如下:在M1區(qū)，麻醉濃度下降，上升時間沒有明顯變化，始終處于0.174s左右。而0.8％麻醉深度下V1區(qū)鈣信號的上升時間是0.170s。綜合分析M1和V1的6組數(shù)據(jù)，沒有統(tǒng)計學差異(p=0.320)。
　　上述結(jié)果表明，皮層集群鈣信號的特征與麻醉深度密切相關(guān)，信號頻率和幅度表現(xiàn)出明顯的濃度依賴特性，而上升時間

9、則與麻醉深度沒有明顯關(guān)聯(lián)。此外，不同皮層的集群鈣信號在相同的麻醉深度下沒有明顯差別。
　　2.自由運動狀態(tài)下M1區(qū)集群鈣信號特點。
　　接下來，我們又記錄了清醒小鼠自由運動情況下的M1區(qū)集群鈣信號，比較了運動與靜止狀態(tài)鈣信號的特點，同時分析了鈣信號與運動的相關(guān)性。
　　(1)運動與靜止狀態(tài)下集群鈣信號特點不同。
　　我們?nèi)匀贿x取M1區(qū)第5層作為記錄位點，待小鼠光纖埋置完畢且麻醉效果已基本消退后，將小鼠放入白色矩形

10、的盒內(nèi)進行鈣信號與行為學的同步記錄。通過分析小鼠運動幅度和鈣信號，我們發(fā)現(xiàn):當小鼠處于清醒自由運動狀態(tài)時，可記錄到高頻發(fā)放的鈣信號(0.42±0.04Hz)，且幅度較大（1.51％±0.06％ΔF/F）;當小鼠處于靜止狀態(tài)時（但不是睡眠狀態(tài)），僅有很少信號被記錄到（0.08±0.01Hz），且幅度較小(0.24％±0.02％ΔF/F)。在運動與靜止狀態(tài)下，鈣信號的頻率和幅度均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001)。為了排除運動噪聲的影響，我們又

11、在Thy1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠M1區(qū)的第5層進行了運動與熒光強度的同步記錄，結(jié)果顯示當小鼠運動時，熒光強度只有很小的變化，將OGB-1AM與GFP的熒光強度的分布進行高斯擬合，擬合優(yōu)度均大于99％，平均值分別為0.3％ΔF/F和1.5％ΔF/F，這些結(jié)果表明我們記錄到的熒光變化不是運動噪聲，而是真正的鈣信號。
　　(2)M1區(qū)集群鈣信號與小鼠運動密切相關(guān)。
　　我們進一步分析了運動與鈣信號的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示:每一個動作必然會伴

12、有相應的鈣信號?；ハ嚓P(guān)分析發(fā)現(xiàn)運動與鈣信號高度相關(guān)(p＜0.05)，而且鈣信號的起始總是超前于運動的起始，超前時間為149.7±10.3ms。將所有超前時間進行高斯擬合，得到擬合中位數(shù)約136ms(n=8)。
　　上述結(jié)果表明，M1區(qū)是與運動行為高度相關(guān)的腦區(qū)，其集群鈣信號反應動物的運動行為并超前于運動。
　　3.自由運動狀態(tài)下V1區(qū)集群鈣信號特點。
　　以往的研究顯示，動物在運動過程中需要視覺信息的輸入來進行引導，而

13、且視覺皮層的神經(jīng)元活動也會受到運動的調(diào)節(jié)。因此，我們猜想在小鼠V1區(qū)也可能存在運動相關(guān)的鈣信號。
　　(1)運動與V1區(qū)集群鈣信號密切相關(guān)。
　　我們同樣在V1區(qū)的第5層注射OGB-1AM并記錄鈣信號。結(jié)果顯示，在V1區(qū)同樣存在與M1區(qū)相似的與運動高度相關(guān)的、并且超前于運動的鈣信號。然而，這種V1區(qū)運動相關(guān)的鈣信號要晚于M1區(qū)，兩者有顯著性差異(M1:149.7±10.3ms versus V1:50.0±4.7ms;p＜0

14、.001)。同時，我們分析了這兩個腦區(qū)鈣信號的幅度，發(fā)現(xiàn)它們并沒有差別(p=0.0854)。值得一提的是，在黑暗環(huán)境中V1區(qū)運動相關(guān)的鈣信號仍然存在，但是其幅度和運動關(guān)聯(lián)性有所降低(n=6，p＜0.001)。
　　(2)M1區(qū)和V1區(qū)第5層集群鈣信號與頭部運動高度相關(guān)。
　　人或動物要想朝著一個目標進行運動，必須獲取自身位置和目標方向。而在運動過程中，頭部運動是感知方向的關(guān)鍵因素。因此，我們猜想頭部運動可能與M1區(qū)和V1區(qū)第

15、5層的集群鈣信號密切相關(guān)。我們分析了三種頭部運動:抬頭、轉(zhuǎn)頭和縮頭。發(fā)現(xiàn):無論哪種頭部運動發(fā)生，都伴有鈣信號的產(chǎn)生。這種鈣信號有以下幾個特點:在M1區(qū)和V1區(qū)均能觀察到這種鈣信號;頭部運動必然伴有鈣信號，相關(guān)率為100％;三種不同頭部運動相關(guān)的鈣信號幅度沒有顯著性差別(M1:p=0.066，n=8;V1:p=0.181，n=7)。
　　以上結(jié)果表明V1區(qū)是另一個與運動密切相關(guān)的重要腦區(qū)，其神經(jīng)活動可能是視覺輸入和運動輸入的綜合體現(xiàn)

16、。頭部運動是整個運動過程的重要環(huán)節(jié)，與M1區(qū)和V1區(qū)的神經(jīng)活動緊密相關(guān)。
　　4.膀胱的中樞控制區(qū)域探索。
　　目前的研究結(jié)果顯示排尿的控制中樞位于腦橋排尿中心(PMC)，然而，是否存在更高級的控制中樞（如大腦皮層）參與排尿的控制，現(xiàn)在仍然沒有直接的證據(jù)。因此，我們通過在小鼠膀胱壁注射經(jīng)典的、逆行跨多級神經(jīng)元的示蹤病毒——偽狂犬病毒(PRV)，來探索可以與膀胱形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的皮層區(qū)域。
　　(1)PRV在小鼠膀胱的標

17、記情況
　　小鼠在病毒注射4-5天后，會表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，如甩尾、啃咬尾部、行動搖擺等。此時將小鼠膀胱、脊髓和腦組織取出，并切片、染色和成像從而獲取形態(tài)學結(jié)果。在完整的膀胱組織及其切片上，我們可以觀察到被PRV標記的神經(jīng)纖維。這說明我們運用神經(jīng)示蹤方法成功地標記了膀胱壁內(nèi)的神經(jīng)纖維。
　　(2)PRV在小鼠脊髓和其他皮層下腦區(qū)的標記情況
　　然后，我們又對脊髓和腦組織進行切片觀察，在腰髓和骶髓副交感神經(jīng)核(

18、SPN)、腦橋排尿中樞(PMC)、藍斑核(LC)、中腦導水管灰質(zhì)(PAG)以及下丘腦室旁核（PVN）等均發(fā)現(xiàn)了被PRV標記的神經(jīng)元，這些腦區(qū)和核團與已經(jīng)研究報道的、公認的排尿控制相關(guān)的區(qū)域相一致。以上結(jié)果證明，我們的病毒標記方法是可用而有效的。
　　(3)PRV在小鼠大腦皮層的表達情況
　　更重要的是，我們在小鼠的大腦皮層也發(fā)現(xiàn)了被PRV標記的一群神經(jīng)元，通過與經(jīng)典的小鼠腦圖譜對比，顯示它們位于初級運動皮層(M1)和初級體感

19、皮層(S1)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，被標記的神經(jīng)元集群在小鼠大腦皮層前后跨度約為1mm，并且以前囟(Bregma)向后0.94mm附近的皮層區(qū)域最為密集。被標記的皮層神經(jīng)元總數(shù)量約為1000個;形態(tài)上顯示大部分為椎體神經(jīng)元，且80％以上均位于皮層的第5層。
　　5.小鼠大腦皮層排尿行為相關(guān)鈣信號的記錄。
　　雖然我們明確了膀胱與M1區(qū)和S1區(qū)之間存在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，但這兩個腦區(qū)在排尿過程中的具體功能仍有待研究。因此我們采用光纖記錄的方

20、法，探究這兩個腦區(qū)在排尿過程中的神經(jīng)活動。
　　(1)M1區(qū)神經(jīng)元鈣信號與排尿行為密切相關(guān)。
　　我們分別對清醒自由運動小鼠鈣染料標記后的M1區(qū)與S1區(qū)第5層神經(jīng)元進行鈣信號和排尿行為的同步記錄。實驗結(jié)果顯示在小鼠排尿時，M1區(qū)總會有記錄到一個明顯的排尿行為相關(guān)的鈣信號，而這種現(xiàn)象在S1區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)。我們又在M1區(qū)的前部Ma區(qū)進行對照記錄，也沒有發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象;對比鈣信號的幅度發(fā)現(xiàn)M1區(qū)明顯高于S1區(qū)與Ma區(qū)。故這種排尿行為相關(guān)

21、的鈣信號具有區(qū)域特異性。我們又對鈣信號與排尿行為的先后順序進行了分析，發(fā)現(xiàn)鈣信號的起始總是超前于排尿行為的起始，平均超前時間約130ms。
　　(2)M1區(qū)與經(jīng)典排尿環(huán)路的投射關(guān)系探索
　　上述結(jié)果提示M1區(qū)（第5層神經(jīng)元）可能是一個新發(fā)現(xiàn)的與排尿行為密切相關(guān)的腦區(qū)，但M1區(qū)是如何參與經(jīng)典排尿行為相關(guān)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)依然不明朗。為了明確M1第5層神經(jīng)元調(diào)控膀胱活動的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)，我們在M1區(qū)第5層神經(jīng)元分別注射AAV和VSV示蹤病