人強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)基因的克隆及分析.pdf

1、研究背景：強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種主要累及脊椎等中軸關(guān)節(jié)和肌腱、韌帶骨附著點(diǎn)的慢性炎性疾病，可引起脊柱骨性強(qiáng)直甚至中軸關(guān)節(jié)的活動(dòng)功能喪失，導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾。AS在中國人群中的發(fā)病率約為0.2％，患者多為青壯年，給患者及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。有文獻(xiàn)報(bào)道HLA-B27、TNF-α、白介素家族、KIR基因家族與AS 關(guān)聯(lián)，但AS 發(fā)病的具體分子機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)有的治療措施難以獲得滿意的療效，因此解析A

2、S 發(fā)病的分子機(jī)制成為有效開展AS 治療的關(guān)鍵。
　　 目的：應(yīng)用表達(dá)譜芯片從AS患者的椎間組織中篩選組織差異表達(dá)基因，應(yīng)用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建AS組織差異基因的消減cDNA文庫，獲得AS 相關(guān)基因序列，為克隆基因全長進(jìn)行基因功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：采用改良RNAiso Plus 法從AS患者椎間組織中提取總RNA作為實(shí)驗(yàn)組，以未患AS的骨折患者椎間組織總RNA為對(duì)照組，制備實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組探針分別與表達(dá)譜芯片進(jìn)行

3、雜交。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組芯片雜交結(jié)果掃描后進(jìn)行比較，篩選出差異表達(dá)基因。以AS 標(biāo)本RNA為Test er，以骨折標(biāo)本RNA為Driver，逆轉(zhuǎn)錄制備雙鏈cDNA。RsaI 酶切雙鏈cDNA后在兩組Test er兩端分別連接不同接頭，將帶接頭的Test er與Driver 進(jìn)行兩輪消減雜交。雜交產(chǎn)物作為模板進(jìn)行巢式PCR，擴(kuò)增獲得消減cDNA。消減cDNA 進(jìn)行T/A 克隆后PCR 檢測排除假陽性，構(gòu)建消減cDNA文庫。將消減cDNA文庫樣

4、本進(jìn)行測序，拼接序列后獲得AS組織高表達(dá)基因。結(jié)合文獻(xiàn)分析表達(dá)譜芯片和SSH 結(jié)果，選擇有價(jià)值的基因作為AS 候選基因，RT-PCR 驗(yàn)證其在AS組織和骨折組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功提取獲得高質(zhì)量的椎間組織總RNA，完整性和純度達(dá)到后實(shí)驗(yàn)要求。表達(dá)譜芯片篩選獲得237 條AS組織差異基因，篩選出20條作為AS 候選基因，RT-PCR檢測表明其在AS組織和對(duì)照組中的表達(dá)情況與芯片結(jié)果基本一致。采用抑制差減雜交成功構(gòu)建含182

5、個(gè)差異基因片段的消減cDNA文庫，測序后拼接獲得32 條AS 候選基因，其中8 條基因確定為AS 相關(guān)基因，包括5 條已知基因和3 條未知基因。RT-PCR檢測8 條基因全部為在AS組織高表達(dá)的差異基因。
　　 結(jié)論：采用改良RNAiso Plus 法提取椎間組織總RNA，可以有效去除蛋白多糖從獲得高質(zhì)量總RNA。采用表達(dá)譜芯片成功獲得237個(gè)AS組織差異基因，采用抑制差減雜交成功構(gòu)建消減cDNA文庫。芯片結(jié)果中篩選到20條AS