飛蝗表皮幾丁質(zhì)有序排列關(guān)鍵基因的功能研究.pdf

1、昆蟲表皮覆蓋整個蟲體，對昆蟲生長發(fā)育具有重要作用。幾丁質(zhì)是表皮的主要成分，其致密排列組裝成精細的表皮結(jié)構(gòu)。由于人類和高等動物體內(nèi)不含幾丁質(zhì)，因此表皮可做為害蟲防治的安全靶標。表皮幾丁質(zhì)的有序排列對維持表皮結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要，表皮幾丁質(zhì)排列關(guān)鍵基因的篩選及功能研究將揭示表皮形成的分子機制，為害蟲防治靶標的研究提供重要的理論依據(jù)。本文以飛蝗（Locusta migratoria）為研究材料，分別對3類幾丁質(zhì)排列關(guān)鍵基因的生物學功能進行探討

2、。研究內(nèi)容如下:
　　一、飛蝗幾丁質(zhì)脫乙?；?CDAs)基因鑒定和分子特性
　　從飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索獲得的CDAs序列進行全長驗證、功能域分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，獲得4條CDAs的全長cDNA序列，分別將其命名為LmCDA1、LmCDA2、LmCDA4和LmCDA5，其中LmCDA2和LmCDA5分別具有2個剪切子，分別為LmCDA2a和LmCDA2b及LmCDA5a和LmCDA5b。采用(reverse transcri

3、ption-quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)對其分子特性進行研究，對各組織部位CDAs表達水平進行檢測，結(jié)果表明LmCDA1和LmCDA4在前腸表達量最高，在體壁和后腸次之。LmCDA2a和LmCDA2b在前腸的表達量顯著高于其他組織。LmCDA5在前腸中表達量最高，體壁、后腸和脂肪體次之。對5齡不同天數(shù)體壁CDAs表達水平進行檢測，結(jié)果表明LmCDAs均在第1和2天表達量最高，隨著天數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而

4、在蛻皮前表達量升高，暗示LmCDAs在飛蝗蛻皮前后發(fā)揮著重要作用。
　　二、飛蝗幾丁質(zhì)脫乙?；?CDAs)基因的生物學功能
　　采用RNAi(RNA interference)技術(shù)對CDAs生物學功能進行研究，結(jié)果表明分別注射CDAs的dsRNA(double-strand RNA)可以特異、高效的沉默靶標基因，且注射dsLmCDA1、dsLmCDA2和dsLmCDA2a后，飛蝗出現(xiàn)難以蛻去舊表皮并最終導(dǎo)致死亡的表型，而注

5、射dsLmCDA2b、dsLmCDA4和dsLmCDA5的蟲體可以成功蛻至下一齡期，未觀察到可見的異常表型。HE染色結(jié)果表明，與對照組相似，注射dsLmCDA1和dsLmCDA2后，飛蝗經(jīng)歷皮層溶離，新表皮合成加厚和舊表皮降解變薄的過程，無肉眼可見的表型。免疫組化結(jié)果表明，LmCDA2位于原表皮最上層，LmCDA1主要位于皮細胞層，此外在外表皮也有可見的熒光信號。殼聚糖染色結(jié)果表明，注射dsLmCDA1后，殼聚糖含量顯著降低，表明幾丁質(zhì)

6、脫乙酰度降低，而注射dsLmCDA2后，與對照組相比，其殼聚糖含量不變，表明幾丁質(zhì)脫乙酰度未發(fā)生改變。透射電鏡觀察結(jié)果表明，注射dsLmCDA1后，仍舊可觀察到幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)，表皮變薄，而注射dsLmCDA2后，幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失，表皮變厚。將LmCDA1和LmCDA2同時沉默后，幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失，其表皮厚度介于分別將LmCDA1和LmCDA2沉默后的表皮厚度之間，表明LmCDA2在表皮幾丁質(zhì)排列中發(fā)揮重要功能，且LmCDA1和LmC

7、DA2對表皮厚度的維持起著重要作用。幾丁質(zhì)含量檢測結(jié)果表明，注射dsLmCDA1后，表皮幾丁質(zhì)含量顯著降低，而注射dsLmCDA2后，表皮幾丁質(zhì)含量未發(fā)生變化，將LmCDA1和LmCDA2同時沉默后，幾丁質(zhì)含量顯著降低。上述結(jié)果表明LmCDA1和LmCDA2在功能上存在分化。
　　三、飛蝗Knickkopf（Knk）基因的分子特性和生物學功能
　　從飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索獲得的LmKnk序列進行全長驗證，獲得LmKnk全長c

8、DNA序列。功能域分析結(jié)果表明，LmKnk包含三個保守功能域。聚類分析結(jié)果表明，LmKnk與其他昆蟲的Knk家族聚為一支，將其命名為LmKnk。采用RT-qPCR對LmKnk進行分子特性研究，不同組織部位表達結(jié)果表明，LmKnk在前腸中表達最高，其次在體壁中表達較高。對LmKnk在5齡不同天數(shù)體壁中表達水平進行檢測，結(jié)果表明LmKnk在五齡整個若蟲期均有表達。預(yù)示LmKnk在5齡整個發(fā)育過程中起著重要作用。采用RNAi技術(shù)將合成的靶基因

9、特異性的dsLmKnk注射到飛蝗體內(nèi)，檢測dsLmKnk對LmKnk基因的沉默效率并對其表型進行觀察，結(jié)果表明dsLmKnk可以高效地沉默靶基因。且注射dsLmKnk后在若蟲-若蟲和若蟲-成蟲期飛蝗均出現(xiàn)蛻皮困難而死亡的表型。HE染色結(jié)果表明，注射dsLmKnk后，飛蝗依舊經(jīng)歷皮層溶離和舊表皮降解變薄，但與對照相比，新表皮顯著變薄。采用幾丁質(zhì)染色實驗對表皮中幾丁質(zhì)含量進行檢測，結(jié)果表明新表皮中幾丁質(zhì)含量顯著下降。透射電鏡觀察結(jié)果表明，注

10、射dsLmKnk后表皮致密排列的幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失，表皮變薄且孔道結(jié)構(gòu)畸形。對表皮幾丁質(zhì)含量進行檢測，結(jié)果表明，注射dsLmKnk后表皮幾丁質(zhì)含量降低。免疫組化結(jié)果表明LmKnk產(chǎn)生于皮細胞中，蛻皮時部分轉(zhuǎn)移至新表皮中，表明其可能參與對新表皮的保護。
　　四、飛蝗Retroactive(Rtv)基因的分子特性和生物學功能
　　將飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已鑒定的LmRtv序列進行全長驗證，獲得LmRtv的全長cDNA序列。檢測LmR

11、tv在不同組織部位和不同天數(shù)體壁中的表達，結(jié)果表明LmRtv在前腸中表達量最高，且在5齡第1和2天表達量最高。注射dsLmRtv后，飛蝗出現(xiàn)蛻皮困難而致死的表型。HE染色結(jié)果表明，注射dsLmRtv后飛蝗依舊出現(xiàn)皮層溶離和舊表皮的降解，但新合成的新表皮量顯著減少。透射電鏡觀察結(jié)果表明，注射dsLmRtv后新表皮片層結(jié)構(gòu)消失，孔道結(jié)構(gòu)膨大而不規(guī)則，表皮厚度與對照組相比顯著變薄。幾丁質(zhì)含量檢測結(jié)果表明，注射dsLmRtv后幾丁質(zhì)含量顯著降低

12、。
　　本文研究發(fā)現(xiàn)，注射dsLmCDA1、dsLmCDA2、dsLmKnk和dsLmRtv后，均可導(dǎo)致飛蝗蛻皮困難而死亡的表型，且表型相似，難以將其區(qū)分開來。因此，進一步借助顯微和超微技術(shù)對其進行深入觀察，結(jié)果表明飛蝗出現(xiàn)蛻皮困難致死的原因不同，LmCDA1定位于皮細胞和外表皮，主要參與幾丁質(zhì)脫乙酰過程，維持表皮中幾丁質(zhì)與殼聚糖含量的平衡。LmCDA2位于原表皮的最外層，主要負責幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)的形成。LmKnk定位于新表皮中，負