普通棉耳狨猴腺病毒5型中和抗體水平測定.pdf

1、腺病毒(Adenovirus)是一種從腺樣體組織分離培養(yǎng)得到的雙鏈DNA病毒，主要在細(xì)胞核內(nèi)繁殖。它不僅是呼吸道、結(jié)膜和腸道感染的常見病原體，還能引起無菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎和肝炎等疾病。腺病毒在自然界廣泛流行，具有傳染性強(qiáng)，宿主范圍廣的特點(diǎn)，尤其對于嬰幼兒、老人、HIV感染者、移植手術(shù)患者等免疫功能低下的人群，腺病毒更是常見的感染因素之一。隨著免疫學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科的相互滲透和發(fā)展，腺病毒在分子水平上的應(yīng)用越來越廣泛，特

2、別是有關(guān)腺病毒感染、抗腺病毒治療和腺病毒載體應(yīng)用已成為研究的熱點(diǎn)。
　　病毒載體疫苗是指以病毒作為載體，將保護(hù)性抗原基因重組到病毒基因組中，使用能表達(dá)保護(hù)性抗原基因的重組病毒制成的疫苗。這種疫苗多為活疫苗，且用量少，抗原的免疫原性接近天然，抗原也不需要純化，接種后靠重組體在機(jī)體內(nèi)大量表達(dá)保護(hù)性抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫保護(hù)反應(yīng)，載體本身亦可發(fā)揮佐劑效應(yīng)來增強(qiáng)免疫效果。多種病毒載體如腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病

3、毒、微小RNA病毒、桿狀病毒等，都已用于疫苗研究，其中腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、痘病毒載體、甲病毒載體等病毒載體疫苗已進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)階段。在這些病毒載體中，人腺病毒載體具有以下優(yōu)點(diǎn):①可裝載外源基因容量大;②安全性好;③規(guī)?；a(chǎn)工藝成熟，制劑穩(wěn)定性好，并可在懸浮培養(yǎng)中獲得較高的滴度;④宿主范圍廣，可感染靜止和分裂的細(xì)胞;⑤腺病毒血清型豐富，疫苗載體選擇廣;⑥腺病毒載體能感染呼吸道和腸道細(xì)胞，可以方便地通過黏膜進(jìn)行免疫，并能誘導(dǎo)機(jī)體

4、產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答;⑦免疫原性強(qiáng)，能產(chǎn)生很強(qiáng)的體液與細(xì)胞免疫;⑧轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，這些優(yōu)點(diǎn)使腺病毒作為載體的基因治療和疫苗研究迅速發(fā)展。
　　目前，應(yīng)用最多的腺病毒載體是人血清腺病毒5型(Human Mastadenovirus5，AdHu5)，主要原因是它的免疫原性比其他腺病毒亞型更強(qiáng)。以重組復(fù)制缺陷型人腺病毒5型(rAd5)為載體的疫苗，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的針對目的抗原的免疫應(yīng)答，因此被廣泛應(yīng)用于人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝

5、病毒、瘧疾、結(jié)核等多種病原體的疫苗研制。然而，近20年來科學(xué)家們研究的重點(diǎn)在于探究限制AdHu5的臨床使用的原因:(1)往人體內(nèi)靜脈注射AdHu5載體時高強(qiáng)度的天然免疫毒性;(2)與劑量依賴相關(guān)的肝毒性;(3)全世界人體內(nèi)存在針對AdHu5的高預(yù)存適應(yīng)性免疫，即人體內(nèi)存在高滴度的預(yù)存中和抗體。由rAD5載體介導(dǎo)的HIV疫苗的臨床試驗(yàn)失敗表明，人體內(nèi)較高滴度的Ad5中和抗體水平會顯著降低載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和外源基因表達(dá)水平，并且可能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生

6、不良反應(yīng)。但AdHu5載體疫苗可以在與人基因同源性高達(dá)99.9％的非人靈長類動物模型上，對疫苗所要引起保護(hù)性免疫的目的基因進(jìn)行免疫原性和耐受性等的評價。因此，首先需要在這種非人靈長類動物上進(jìn)行AdHu5中和抗體水平檢測。
　　近年來，一種廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究的新世界靈長類動物——普通棉耳狨猴（common marmoset，學(xué)名Callithrix jacchus）已走入科學(xué)界。普通棉耳狨猴是一種原產(chǎn)于巴西東北

7、部大西洋沿海森林的新世界非人靈長類動物，屬絨科（Callitrichidae）。與其他靈長類動物相比，普通棉耳狨猴的壽命較短，一般在18～24個月成年，雌性狨猴3歲后可繁殖后代，8歲就步入老年期。由于壓縮的壽命及良好的繁殖效率，科學(xué)家認(rèn)為狨猴可滿足快速擴(kuò)充實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量及限制實(shí)驗(yàn)動物增殖的需求。成年普通棉耳狨猴重約350～400克，體型小巧，性情溫順，對環(huán)境的破壞能力極小，因此適用于人工飼養(yǎng)繁殖及實(shí)驗(yàn)需求，這一優(yōu)勢帶來的巨大效應(yīng)不僅減少了

8、喂養(yǎng)成本和空間需求，更增加了實(shí)驗(yàn)材料的利用效率。多種實(shí)驗(yàn)證明，普通棉耳狨猴是一個優(yōu)秀的研究老化、生殖、神經(jīng)學(xué)、毒理學(xué)和傳染病的模型。狨猴模型的大幅度使用對加速疫苗的臨床前開發(fā)過程及高致病性病毒的治療起了巨大的推動作用。但有學(xué)者研究巴西與美國新世界猴體內(nèi)腺病毒水平，發(fā)現(xiàn)有來自巴西的普通棉耳狨猴中人腺病毒5型中和抗體陽性率為31.3％，而美國的普通棉耳狨猴暫未發(fā)現(xiàn)陽性，可能與飼養(yǎng)環(huán)境及接觸生物有關(guān)。而我國引進(jìn)飼養(yǎng)和繁殖的普通棉耳狨猴的人腺病

9、毒5型中和抗體水平未見報道。本實(shí)驗(yàn)室課題組前期構(gòu)建了HCV/GBV-B嵌合病毒感染狨猴模型，預(yù)以該狨猴模型進(jìn)行腺病毒載體丙型肝炎病毒候選疫苗的臨床前評價，首先需以人腺病毒5型作為載體，在狨猴模型上對所要研究的病毒基因進(jìn)行免疫原性和耐受性等的評價，因此在使用載體前檢測其體內(nèi)人5型腺病毒的中和抗體水平就顯得極為重要。
　　目的:
　　本研究旨在測定普通棉耳狨猴血清中的腺病毒5型中和抗體水平，評價采用化學(xué)發(fā)光法或流式細(xì)胞術(shù)分別測定

10、熒光素酶或綠色熒光蛋白表達(dá)抑制情況的中和檢測方法，評估普通棉耳狨猴作為重組腺病毒5型疫苗臨床前研究的動物模型的可行性與適用性，為臨床前試驗(yàn)用HCV疫苗候選株與產(chǎn)品的研發(fā)、最終實(shí)現(xiàn)HCV疫苗研制成功并在我國產(chǎn)業(yè)化提供重要背景信息。
　　方法:
　　目前對人或動物血清中和抗體的檢測方法有兩種，一種是野生型腺病毒被抗體中和后，觀察感染細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE);另一種則是復(fù)制缺陷腺病毒與血清中抗體反應(yīng)后，讀取其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表

11、達(dá)抑制情況，較常使用的報告基因包括熒光素酶(Luciferase)、綠色熒光蛋白(Zs Green)、半乳糖苷酶基因(LacZ)等。由于CPE的觀察較主觀，細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，不適宜快速檢測大樣本血清，因此本實(shí)驗(yàn)選取后一種檢測方法，即構(gòu)建同時表達(dá)Luciferase與ZsGreen報告基因的重組復(fù)制缺陷型5型腺病毒，來檢測普通棉耳狨猴血清中的腺病毒5型中和抗體水平。
　　首先通過PCR技術(shù)從質(zhì)粒pHAGE-CMV-Luc-IZs G

12、reen中擴(kuò)增Luc-IZs Green目的基因，同時通過引物設(shè)計分別在目的基因5'、3'端引入EcoRⅠ與NheⅠ酶切位點(diǎn)。將目的序列插入腺病毒表達(dá)質(zhì)粒pDC315中，構(gòu)建成重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-Luc-IZs Green。接著利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre按一定比例轉(zhuǎn)染能提供反式作用E1蛋白的人胚腎293A包裝細(xì)胞，從而包裝成具有一定感染活性的攜帶Lucif

13、erase與Zs Green報告基因的重組腺病毒rAd5/LUC/Zs Green。對包裝好的rAd5/LUC/Zs Green進(jìn)行3次空斑形成實(shí)驗(yàn)，篩選單克隆重組腺病毒，并將低滴度單克隆病毒原液于293A細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增。rAd5/LUC/Zs Green大量擴(kuò)增后采用氯化銫密度梯度離心法對其進(jìn)行濃縮純化，并通過50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測得純化后重組腺病毒的感染滴度。通過分子克隆技術(shù)鑒定純化后重組腺病毒仍攜帶Luci

14、ferase與Zs Green報告基因，即分別采用PCR或RT-PCR擴(kuò)增純化后rAd5/LUC/Zs Green的基因組DNA或細(xì)胞內(nèi)總RNA中的Luc-IZs Green基因片段。同時使用細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組腺病毒蛋白在293A細(xì)胞中是否有表達(dá)。再將純化后rAd5/LUC/Zs Green進(jìn)行倍比稀釋感染293A細(xì)胞，檢測熒光素酶與綠色熒光蛋白報告基因的表達(dá)效率，確定腺病毒中和實(shí)驗(yàn)的最佳病毒感染滴度。最后將25只普通棉耳狨猴的血

15、清進(jìn)行倍比梯度稀釋，與最佳感染滴度的重組腺病毒混合后感染293A細(xì)胞，24小時后分別采用化學(xué)發(fā)光法與流式細(xì)胞術(shù)相應(yīng)檢測Luciferase與Zs Green報告基因。通過兩種報告基因的讀數(shù)判定狨猴有無中和抗體及其抗體滴度。
　　結(jié)果:
　　(1)重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建
　　用分子克隆常規(guī)的方法成功構(gòu)建與正確鑒定含有兩種報告基因的腺病毒穿梭載體pDC315-Luc-IZs Green，并通過瞬時轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞的方法初步鑒定能

16、正確表達(dá)標(biāo)簽蛋白。
　　(2)重組腺病毒包裝與滴度測定
　　通過共轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒和ADMax包裝系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒至293A細(xì)胞，成功包裝rAd5/LUC/Zs Green。經(jīng)過3次空斑形成實(shí)驗(yàn)、大量擴(kuò)增單克隆重組腺病毒并對其進(jìn)行濃縮純化后，采用TCID50方法測得腺病毒滴度為6.9×10115PFU/ml。
　　結(jié)論:
　　(1)采用新型ADMax腺病毒包裝系統(tǒng)，包裝出同時攜帶熒光素酶與綠色熒光蛋白報告

17、基因的重組腺病毒rAd5/LUC/Zs Green。
　　(2)檢測了我國25只普通棉耳狨猴中預(yù)存腺病毒5型抗體水平。普通棉耳狨猴的抗Ad5血清流行率約為20％～30％，但抗體水平均低，多數(shù)滴度是1/16，少數(shù)在1/32，極少出現(xiàn)中高滴度。
　　(3)比較以Luciferase或Zs Green報告基因表達(dá)的抑制情況計算得出中和抗體水平的兩種不同檢測方法，證實(shí)化學(xué)發(fā)光法是重復(fù)性高、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，適宜多物種大樣本實(shí)驗(yàn)設(shè)計