牙齒發(fā)育的信號調(diào)控機制及淫羊藿苷的干預研究.pdf

1、研究目的:
　　 1.進一步明確將斑馬魚作為牙齒發(fā)生發(fā)育分子生物學研究模型的可行性和先進性。
　　 2.研究牙齒發(fā)育的重要信號因子(Pax9基因、Pitx2基因)在斑馬魚牙齒萌出與替換過程中的表達部位和時間,以探討Pax9基因、Pitx2基因在牙發(fā)生發(fā)育過程中的作用機制及作用途徑。
　　 3.研究淫羊藿苷對牙齒生長發(fā)育的影響。這將加快實現(xiàn)牙齒再生目標,并將為選取中藥進行牙齒再生的體內(nèi)實驗提供一定的理論依據(jù)。

2、>　　 研究方法:
　　 1.斑馬魚的飼養(yǎng)及其受精卵的獲得:將飼養(yǎng)野生型斑馬魚的水溫控制在28.5℃,設定其晝夜規(guī)律分別為14小時和10小時。將通過自然交配獲得的受精卵飼養(yǎng)于28.5℃水中。斑馬魚的發(fā)育階段按下述方法來劃分:孵化期(0-6天齡);幼蟲期(1-4周齡,即7-49天齡);幼體期(1-3月齡,即30一89天齡);成熟期(3月齡以上)。
　　 2.成年斑馬魚牙齒形態(tài)和組織學觀察:在體視顯微鏡下,解剖成年斑馬魚鰓

3、弓,觀察其牙齒,并做石蠟切片和HE染色觀察。取單個牙齒進行組織學標本處理,掃描電鏡下觀察其顯微結構。
　　 3.針對Pax9基因原位雜交探針的制備:根據(jù)斑馬魚Pax9基因mRNA序列(GenBank:NM_131298)設計和合成針對Pax9的引物(F:5'-gcaagcttatggaaatctgcagaggcct;R:5'-getggatcccgctcgtcctcctggaagtagaa)。抽提斑馬魚基因組總RNA,反轉錄成c

4、DNA,并以此為模板,擴增Pax9基因序列。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。將純化的PCR擴增產(chǎn)物連接到pGEMT。(Promage,Cat.＃A3600)載體中,然后轉化到DH5a感受態(tài)菌株中克隆擴增質(zhì)粒。將大量擴增抽提得到的連接載體質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶消化,在含有地高辛標記的UTP的體外轉錄系統(tǒng)中,以T7聚合酶催化合成地高辛標記的RNA探針,用于整胚原位雜交。
　　 4.Pax9基因在受精72h以內(nèi)斑馬魚胚胎中的分布和表達:參考We

5、sterfieldM.TheZebrafishBook.Eugene:UniversityofOregonPress,1995.中的整胚原位雜交和胚胎切片方法,取不同發(fā)育階段的胚胎(以4h為觀察間隔),用4％多聚甲醛溶液固定過夜(至少固定12h),保存于甲醇溶液中,置-20℃?zhèn)溆?。?×PBST溶液洗去多余的甲醇溶液,將胚胎置于65℃水浴箱進行預雜交3h,然后加入所合成的反義RNA探針,65℃水浴雜交過夜。用0.2×SSC溶液洗去多余的

6、探針,加入anti-Dig-AP與反義RNA探針結合過夜。將未結合的抗體用1×PBST溶液洗去,再加入(BCIP/NBT/NTMT)顯色30min,迅速用1×PBST溶液洗去多余的顯色液,將此胚胎直接在顯微鏡下觀察并記錄結果。
　　 5.通過制備針對Pitx2基因的探針(同研究方法3),利用整胚原位雜交技術(同研究方法4)觀察Pitx2基因在斑馬魚牙齒早期發(fā)育中的表達情況。
　　 6.研究淫羊藿苷對牙齒生長發(fā)育的影響:在

7、飼養(yǎng)野生型斑馬魚的水中加入淫羊藿苷,觀察45天后斑馬魚牙齒生長發(fā)育的變化。在掃描電鏡下觀察其牙齒的顯微結構,并對Ca、P等微量元素做能譜分析。
　　 7.研究淫羊藿苷對人牙齦成纖維細胞的中藥干預作用:對體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞(humangingivalfibroblasts,HGF),用MTT法檢測不同濃度的淫羊藿苷(0.001、0.01、0.1μg/mL)、不同時間(24、48、72、96h)作用下HGF的增殖水平。

8、>　　 研究結果:
　　 1、掃描電鏡下,斑馬魚牙齒硬組織也具有類似人類牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)樣的結構。人類牙齒的釉質(zhì)表面有平行排列的與牙長軸垂直的淺凹線紋和不規(guī)則的圓形小凹。斑馬魚牙齒表面未見淺凹線紋,但是有一些與牙長軸垂直的顏色較深的條帶,在外形變化大的牙尖處尤為明顯,這可能同人類牙釉質(zhì)表面的線紋一樣和釉質(zhì)沉積有關。人類牙齒的牙本質(zhì)具有牙本質(zhì)小管,為多孔性組織結構,牙本質(zhì)構成髓腔,髓腔內(nèi)充滿牙髓等軟組織。斑馬魚的釉質(zhì)內(nèi)側組織也呈多

9、孔性疏松組織結構,具有很多貫穿其內(nèi)的孔隙,與人類牙齒的牙本質(zhì)結構相似。斑馬魚牙齒的牙本質(zhì)也圍成一髓腔,其內(nèi)也可見軟組織。HE染色進一步觀察到紅染的牙本質(zhì)內(nèi)部為一髓腔,髓腔內(nèi)具有豐富的牙髓細胞。
　　 2、得到了Pax9基因在0到7天各時期斑馬魚胚胎中的表達資料,其中Pax9基因在受精16h的斑馬魚胚胎中開始有特異性信號出現(xiàn),還可以明顯地看到鰓弓(鰓弓,包括牙齒是由神經(jīng)嵴細胞遷徙分化而來)上的特異性信號從24h-72h的遷徙和發(fā)育

10、的過程。
　　 3.得到了Pitx2基因在0到7天各時期斑馬魚胚胎中的表達資料,明顯地看到鰓弓上的特異性信號從16h-72h的遷徙和發(fā)育的過程。
　　 4.與對照組相比,實驗組(加淫羊藿苷組)中斑馬魚牙齒冠1/3和中1/3的Ca含量顯著升高,P含量顯著降低,Ca/P比值顯著升高。淫羊藿苷對斑馬魚牙齒生長發(fā)育中的鈣化沉積有明顯的促進作用。
　　 5.淫羊藿苷(0.001～0.1μg/mL)對人牙齦成纖維細胞(hum

11、angingivalfibroblasts,HGF)的增殖具有促進作用(P＜0.01),而且呈時間依賴性,促進HGF增殖的最佳濃度為0.01μg/mL。
　　 結論:
　　 1.進一步明確了斑馬魚作為牙發(fā)生發(fā)育分子生物學研究模型的可行性和先進性。從組織結構和超微結構上分析,斑馬魚牙齒和人類牙齒具有相似性,能夠作為研究牙齒發(fā)生發(fā)育的新型模式動物。
　　 2.掌握了Pax9基因、Pitx2基因在斑馬魚牙齒發(fā)育和替換過