重組大鼠CC16蛋白質(zhì)對(duì)LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、CC16蛋白質(zhì)主要由位于終末細(xì)支氣管的無纖毛柱狀上皮細(xì)胞（Clara cell）分泌產(chǎn)生，其分子量接近16kD，所以稱之為CC16。目前認(rèn)為CC16是肺的內(nèi)源性抗炎因子，具有重要的免疫炎癥調(diào)節(jié)作用。慢性炎癥性肺部疾病例如COPD，患者肺內(nèi)Clara細(xì)胞及CC16明顯降低，促進(jìn)了疾病的發(fā)生發(fā)展。參與COPD發(fā)病的重要炎癥介質(zhì)包括MMP-9，IL-6，IL-8，TNF-α，而NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中具有重要地位。外源性給予抗炎因子CC

2、16，有可能抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而對(duì)炎癥性肺部疾病產(chǎn)生治療干預(yù)作用。本研究首先利用基因工程技術(shù)，誘導(dǎo)表達(dá)重組的CC16蛋白質(zhì)，純化并鑒定具有生物學(xué)活性后，用于炎癥干預(yù)研究。通過 LPS刺激誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠氣道上皮細(xì)胞，產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)，給予重組的CC16蛋白質(zhì)進(jìn)行干預(yù)后，觀察各炎癥因子的變化。進(jìn)一步應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，探討重組CC16抑制炎癥因子產(chǎn)生的分子機(jī)制。為重組CC16作為抗炎劑用于炎癥性肺疾病，如COPD等疾病的治療提供理

3、論依據(jù)。
　　第一部分大鼠Clara細(xì)胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表達(dá)及純化
　　目的：
　　克隆大鼠Clara細(xì)胞分泌蛋白（CC16）基因，原核表達(dá)并純化重組的CC16蛋白，為進(jìn)一步研究CC16蛋白的功能及對(duì)炎癥性肺部疾病的治療作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　制備大鼠肺組織總RNA，根據(jù)大鼠CC16基因全長(zhǎng)編碼序列（GenBank登錄號(hào)：NM_013051）的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（R

4、T-PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入pET30a（+）原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α），陽(yáng)性克隆經(jīng)菌液PCR、雙酶切及測(cè)序進(jìn)行鑒定。將重組質(zhì)粒pET30a（+）-rCC16轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta（DE3）并加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，重組融合蛋白經(jīng)Ni2+瓊脂糖凝膠親和純化。分

5、別以抗His標(biāo)簽抗體和山羊抗CC16抗體進(jìn)行免疫印跡（Western blotting）分析并鑒定重組蛋白。采用高效液相色譜法測(cè)定重組蛋白的純度。
　　結(jié)果：
　　RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為290 bp。菌落PCR、雙酶切及測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET30a（+）-rCC16構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得相對(duì)分子質(zhì)量約16 kD的可溶性重組蛋白。免疫印跡（Western blotting）結(jié)果表明，誘導(dǎo)

6、表達(dá)的蛋白質(zhì)為帶His標(biāo)簽的重組融合蛋白，而且能被山羊抗CC16抗體識(shí)別。經(jīng)測(cè)定重組CC16蛋白質(zhì)純度為96.03％
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建基因重組體pET30a（+）-rCC16，并制備出可溶性大鼠重組CC16蛋白質(zhì)。
　　第二部分重組CC16蛋白質(zhì)通過NF-κB信號(hào)通路抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的氣道上皮炎癥介質(zhì)的表達(dá)
　　第一節(jié)重組CC16蛋白質(zhì)對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-8、IL-6、TNF-：和MMP-9表達(dá)的

7、影響
　　目的：
　　明確重組大鼠CC16（rCC16）對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的干預(yù)作用。
　　方法：
　?。?）采用酸堿滴定法，通過測(cè)定磷脂酶A2（PLA2）的活性，驗(yàn)證重組的CC16蛋白質(zhì)是否具有生物學(xué)活性。
　?。?）體外培養(yǎng)大鼠氣道上皮（RTE）細(xì)胞，以不同劑量rCC16（5、10和20μg/ml）與RTE共孵育1、3、5、7天，采用CCK-8試劑盒和臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定rCC16對(duì)RTE細(xì)胞增殖及活力

8、的影響。
　?。?）體外培養(yǎng)RTE細(xì)胞，加入LPS（0.1μg/ml）刺激細(xì)胞，并以不同劑量rCC16（0.5、1.0和2.0μg/ml）進(jìn)行干預(yù)24h。采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清中MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-α的含量；采用反轉(zhuǎn)錄qPCR法測(cè)定各組細(xì)胞MMP-9、IL-6和TNF-αmRNA水平；采用明膠酶譜法測(cè)定MMP-9的活性。
　　結(jié)果：
　?。?）體外實(shí)驗(yàn)顯示rCC16可抑制PLA2的活性，并呈劑

9、量依賴性，在劑量為0.5μg/ml時(shí)即有抑制作用，隨著劑量的增大（1.0和2.0μg/ml），rCC16對(duì)PLA2的抑制作用更加明顯。
　?。?）rCC16在較大劑量時(shí)（10μg/ml和20μg/ml）對(duì)RTE細(xì)胞的增殖有抑制作用，但對(duì)RTE的細(xì)胞活性無影響。根據(jù)以上兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇低劑量rCC16（小于5μg/ml）作為干預(yù)研究的劑量，該劑量下rCC16對(duì)細(xì)胞增殖及活性無影響，同時(shí)又具備了生物活性。
　?。?）LP

10、S刺激RTE細(xì)胞24h后，MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA及蛋白含量較對(duì)照組明顯升高，MMP-9活性亦增高。給予不同劑量rCC16干預(yù)后，LPS誘導(dǎo)的上述炎癥介質(zhì)的表達(dá)被抑制。rCC16對(duì)MMP-9、IL-6和IL-8的抑制作用呈劑量依賴性，隨著rCC16劑量增加抑制作用增強(qiáng)，而對(duì)TNF-α的抑制則表現(xiàn)為低劑量rCC16（0.5μg/ml）強(qiáng)于較高劑量組。
　　結(jié)論：
　　rCC16蛋白質(zhì)具有抗炎活性，在不

11、影響 RTE細(xì)胞增殖及活性的劑量下，可抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-9、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA及蛋白的表達(dá)。
　　第二節(jié)重組CC16蛋白質(zhì)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化及其機(jī)制研究
　　目的：
　　探討rCC16抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)RTE細(xì)胞，加入LPS刺激細(xì)胞，并以不同劑量rCC16進(jìn)行干預(yù)1h。以雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)各組 NF-κB的轉(zhuǎn)錄活

12、性。提取胞核蛋白，采用電泳遷移率（EMSA）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB與靶基因的結(jié)合能力。分別提取胞漿、胞核蛋白，采用Western blotting法檢測(cè)NF-κBp65的核漿含量，同時(shí)用免疫熒光染色顯示NF-κBp65的胞內(nèi)分布。應(yīng)用Western blotting檢測(cè)LPS刺激及rCC16干預(yù)后RTE細(xì)胞I-κBα、p-I-κBα、p-NF-κB、total NF-κB、p38和p-p38的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）LPS

13、刺激后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯增高，較空白對(duì)照組高出約9倍。1μg/ml和2μg/ml的rCC16均可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，并呈劑量依賴性，抑制率分別為38.8%和62.6%。
　?。?）LPS可促進(jìn)RTE細(xì)胞NF-κB與DNA的結(jié)合，而1μg/ml和2μg/ml的rCC16可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB與DNA的結(jié)合。
　?。?）LPS刺激RTE細(xì)胞后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量明顯增多，給予不同劑量rCC

14、16干預(yù)后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量較單純LPS組明顯降低，并具有劑量依賴性，隨著rCC16劑量增加，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量更少。（4）LPS刺激RTE細(xì)胞后磷酸化的IκBα、NF-κBp65和p38明顯增多。不同劑量rCC16干預(yù)后，它們的磷酸化水平較單純LPS刺激組下降，并呈劑量依賴性，隨rCC16劑量增加對(duì)IκBα、NF-κBp65和p38磷酸化的抑制作用增加。
　　結(jié)論：
　　rCC16可通過兩條途徑抑制LPS誘導(dǎo)的R

15、TE細(xì)胞抑制NF-κB的活化：
　　①抑制I-κB的磷酸化，從而抑制NF-κB的核定位；
　　②抑制p38的磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κBp65的磷酸化。
　　第三部分重組 CC16蛋白質(zhì)通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞入胞機(jī)制的初步探討
　　目的：
　　初步探討網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（CME）在rCC16進(jìn)入RTE細(xì)胞及其發(fā)揮抗炎效應(yīng)中的作用。
　　方法：
　?。?）體外培養(yǎng) RTE細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、rCC1

16、6組和 Chlorpromazine（CME抑制劑）+rCC16組。Chlorpromazine+rCC16組在加入Chlorpromazine(30μM）30 min后在加入rCC16（2μg/ml），rCC16組直接在培養(yǎng)基中加入rCC16（2μg/ml）。采用免疫熒光染色法，一抗采用抗His標(biāo)簽抗體，觀察各組細(xì)胞rCC16的分布情況。
　?。?）體外培養(yǎng)RTE細(xì)胞，在培養(yǎng)體系中加入Chlorpromazine抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)

17、的內(nèi)吞作用后，以rCC16干預(yù)LPS刺激的細(xì)胞，采用Western blotting和免疫熒光染色法檢測(cè)各組RTE細(xì)胞NF-κB的核定位情況，采用Elisa法檢測(cè)細(xì)胞上清中MMP-9的含量。
　　結(jié)果：
　　（1）rCC16進(jìn)入RTE細(xì)胞，主要分布于胞漿中，若于rCC16加入前，先給予網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞的抑制劑 Chlorpromazine，則顯示 RTE細(xì)胞中紅色熒光分布明顯減少，提示進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的rCC16減少。
　　

18、（2）在加入rCC16前給予Chlropromazine，則rCC16對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB核定位的抑制作用減弱，即核內(nèi)NF-κB含量仍較多，相應(yīng)地，胞漿中NF-κB含量較rCC16干預(yù)組減少。
　?。?）如果在加入rCC16前，給予網(wǎng)格蛋白抑制劑Chlropromazine，則發(fā)現(xiàn)rCC16對(duì)LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)的抑制作用減弱，即上清液中MMP-9含量仍較多。
　　結(jié)論：
　　抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞后，rCC