EHECO157：H7部分蛋白的原核表達(dá)純化及免疫學(xué)特性研究.pdf

1、目的：
　　腸出血性大腸桿菌O157：H7（EHEC O157：H7）是全球食源性疾病的主要病原之一，自從1982年被報道作為一種腸道致病菌以來，已經(jīng)在我國以及世界范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)流行，散發(fā)病例更是經(jīng)常見諸各種臨床雜志和報道。EHEC O157：H7感染對人類健康和食品行業(yè)都帶來了明顯的經(jīng)濟(jì)損失。由于尚未有預(yù)防或者特殊的治療方式，了解EHEC O157：H7如何感染宿主及其致病方式對于避免EHEC O157：H7的暴發(fā)和改進(jìn)治療

2、方式將有重要意義，對有針對性地開發(fā)治療創(chuàng)新藥物、設(shè)計治療方案、研制有效疫苗、制定預(yù)防控制措施具有重要的理論指導(dǎo)作用。大腸桿菌引起感染主要取決于其毒力因子，目前研究報道較多的有緊密黏附素（Intimin）及緊密黏附素受體（Tir）和III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白。EHEC O157:H7通過III型分泌系統(tǒng)將其毒力蛋白轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞內(nèi)，與宿主細(xì)胞發(fā)生作用，介導(dǎo)宿主肌動蛋白聚集，引起粘附與擦拭（A/E）損傷。但是此過程中具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至今尚不

3、清楚。了解引起粘膜擦拭損傷相關(guān)的蛋白，對闡明EHEC O157:H7的致病機(jī)制有重要的意義。
　　本研究的目的是對預(yù)測的EHEC O157:H7 III型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白進(jìn)行逐級篩選鑒定，對篩選出的Z2322、Z2340等7個蛋白基因進(jìn)行克隆表達(dá)及純化，并進(jìn)行動物實驗，分析成功表達(dá)純化的Z2322、Z2340等5個蛋白在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)一步明確其刺激小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型（Th1/Th2），為研究Z232

4、2、Z2340等5個蛋白在EHEC O157: H7的致病機(jī)制中的作用以及為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　以EHEC O157: H7 EDL933菌株基因組為基礎(chǔ)，用LipoP等七個在線預(yù)測軟件預(yù)測Z2322、Z2340等7個蛋白是否含有信號肽、是否可能為內(nèi)膜蛋白或者外膜蛋白、預(yù)測其亞細(xì)胞定位并分析其核苷酸序列的保守性。以EHEC O157：H7 EDL933菌株基因組為模板對Z2322、Z2340等7個蛋白的

5、基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時引入酶切位點 BamHI和 XhoI，目的基因雙酶切后的回收產(chǎn)物分別與pET-22b（+）等四個表達(dá)載體相連，轉(zhuǎn)化到E. Coli BL21（DE3）中，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白，并對融合蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行鑒定。將成功表達(dá)的蛋白用Ni親和柱進(jìn)行純化并制備鼠抗蛋白血清，采用 ELISA方法檢測蛋白的免疫原性。將免疫的小鼠分別在21、28、35、42天尾靜脈采血收集血清，ELISA檢測IgG抗體及其亞型（I

6、gG1、IgG2a、IgG3）的效價，分析其刺激小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型（Th1/Th2）。將免疫后的小鼠用EHEC O157：H7 EDL933株進(jìn)行攻毒，檢測蛋白對小鼠的保護(hù)性。在攻毒后每日采集小鼠糞便檢測其活菌排菌量，確定蛋白對細(xì)菌定植的影響。
　　結(jié)果：
　　1.通過LipoP、Lipo、SignalP4.1軟件預(yù)測，Z2322、Z2340、Z2354、Z2691、Z3074、Z3322和Z3955蛋白不存在信號肽。經(jīng)

7、預(yù)測軟件TmHmm和Bomp分析，這些蛋白不存在α-螺旋和β-桶狀結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位軟件 PSORTb3.0.2和CELLO v.2.5分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白可能分泌至細(xì)胞外，且通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)這些蛋白核苷酸序列保守性較高。
　　2.成功克隆 Z2322、Z2340等七個預(yù)測蛋白基因片段并構(gòu)建出重組質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)出E.coli BL21-pET-28a-Z2691、E.coli BL21-pET-30a-Z2322

8、等10個重組蛋白。其中E.coli BL21-pET-28a-Z2691等5個蛋白在上清中表達(dá)，為可溶性蛋白；E.coli BL21-pET-30a-Z2322等5個蛋白以包涵體的形式表達(dá)在沉淀中。
　　3.用不同的方法分別純化可溶性蛋白和包涵體蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白分子量大小與預(yù)期一致。ELISA方法檢測Z2322、Z2340、Z2691、Z3322和Z3955抗血清的效價，Z2340、Z2691和Z3955為6250

9、0EU，Z2322為12500EU，Z3322為2500EU。Z2322、Z2340、Z2691、Z3322能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生的以Th2型免疫占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答，Z3955能刺激機(jī)體產(chǎn)生以Th1型免疫占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答。
　　4.免疫保護(hù)性實驗顯示，Z2340、Z2691和Z3955、Z2322能降低小鼠死亡率對其產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，Z3322能延長小鼠的存活時間，對其產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。這與ELISA方法檢測各蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的抗血