河南省櫻桃谷鴨乙型肝炎病毒(DHBV)分子流行病學(xué)調(diào)查及FNC抗DHBV體內(nèi)試驗(yàn)研究.pdf

1、人乙型肝炎(Heptitis B)是危害人類健康的主要疾病之一,全世界乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒攜帶者超過(guò)4億人。預(yù)防和治療乙型肝炎的主要手段是使用疫苗免疫或化學(xué)藥物。我國(guó)用于治療人類乙型肝炎的藥物大多依靠進(jìn)口或仿制,在臨床應(yīng)用上尚無(wú)療效顯著的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)藥物。本文在調(diào)查河南省櫻桃谷鴨主產(chǎn)區(qū)鴨乙肝病毒(Duck heptitis Bvirus,DHBV)自然率的基礎(chǔ)上,分析其分子流行病學(xué)特征并建立鴨乙肝動(dòng)物模型。同時(shí),應(yīng)用建立

2、的檢測(cè)DHBV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法,并結(jié)合病理學(xué)檢查評(píng)價(jià)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新藥FNC抗鴨乙型肝炎的療效,結(jié)果如下:
　　 為了解河南省櫻桃谷鴨中鴨乙肝病毒的自然感染率以及基因結(jié)構(gòu)特征,從河南省櫻桃谷鴨主產(chǎn)區(qū)信陽(yáng)、鄭州、焦作三地采集櫻桃谷鴨血清并用PCR檢測(cè),將三地檢測(cè)到的DHBV陽(yáng)性鴨血清各挑取一份進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增,并進(jìn)行克隆與序列測(cè)定分析。結(jié)果表明,信陽(yáng)、鄭州、焦作三地櫻桃谷鴨DHBV自然攜帶率分別為10

3、.5％、8.9％、42.9％,病毒基因組全長(zhǎng)分別為3021bp、3027bp、3024 bp,均編碼P,S和C蛋白的三個(gè)開放閱讀框,核苷酸同源性為89.8％～93.9％,各開放閱讀框氨基酸同源性比較顯示差異顯著地方位于P區(qū)。與GenBank已公布的DHBV全基因比對(duì),相似性為89.4％～99.5％。全基因組進(jìn)化樹分析表明得到的信陽(yáng)分離株為兩方基因型,其余兩株均為中國(guó)基因型的一個(gè)亞型。進(jìn)一步研究表明S-ORF在1～35aa內(nèi)有一個(gè)明顯的信

4、號(hào)膚,在27～29aa處有裂解位點(diǎn),抗原位點(diǎn)主要分布于PreS區(qū)氨基酸序列中。
　　 為建立一種快速、特異的DHBV-DNA SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法。參考Günther等擴(kuò)增HBV基因組的引物設(shè)計(jì)策略,設(shè)計(jì)擴(kuò)增DHBV基因組的引物,并將DHBV基因組擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18-T載體上。然后以該重組質(zhì)粒為模板,選擇DHBV S基因保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)定量PCR引物,構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試

5、驗(yàn)。結(jié)果表明,該方法能特異性定量檢測(cè)DHBV-DNA；檢測(cè)范圍在7.02×108～7.02×104拷貝/μL之間有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為1.00,擴(kuò)增效率為105％；敏感度高,最低檢測(cè)限為70個(gè)拷貝。建立的DHBV SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法具有特異、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn),可用于DHBV-DNA的定量檢測(cè)和抗DHBV藥物的評(píng)價(jià)。
　　 為了研究FNC的體內(nèi)抗DHBV效果,選用3日齡櫻桃谷鴨感染DHBV,7天后用

6、PCR法篩選出DHBV陽(yáng)性鴨,隨機(jī)分為FNC高、中、低劑量組、拉米夫定對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組,每組16只,各組均灌服給藥10天,于用藥前(TO)、用藥第5天(T5)、用藥第10天(T10)和停藥后第3天(P3)分別采取血液和肝組織,用熒光定量PCR方法檢測(cè)血清和肝臟中DHBV-DNA含量,用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平,取肝組織作常規(guī)HE染色觀察病理變化。結(jié)果顯示:給藥5天、10天時(shí)血清和肝組

7、織中DHBV-DNA總體水平顯著下降(P<0.05),停藥后第3天DHBV-DNA含量較用藥時(shí)有所同升。FNC高劑量組和拉米夫定對(duì)照組對(duì)DHBV-DNA的抑制率差異不顯著(P>0.05)。用藥前期ALT、AST藥物組與生理鹽水對(duì)照組相比差異顯著,后期差異不顯著。肝組織病理切片顯示FNC高劑量組與拉米夫定組炎癥改善情況相當(dāng)。結(jié)果表明,FNC在體內(nèi)有顯著的抗DHBV作用。本試驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究和開發(fā)FNC治療乙型肝炎新藥提供了理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)