四川地區(qū)鴨肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、為更好了解四川地區(qū)鴨肝炎病毒流行情況，本研究以從四川地區(qū)采集到8份疑似鴨病毒性肝炎病料為材料，開展了病毒的分離鑒定、VP1基因的克隆測(cè)序、序列變異分析等幾個(gè)方面的研究。
　　 1.通過雞胚尿囊腔接種分離病毒，得到2個(gè)病毒分離株，命名為ZJD和ZJM。所分離毒株在48h～84h即可100％引起9日齡雞胚死亡。死亡雞胚發(fā)育不良，水腫，全身出血，尤其是胚體頭部及腳爪。剖檢見肝臟充血出血。尿囊液變綠或變黃。對(duì)分離毒株經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn)以及雞

2、胚半數(shù)致死量試驗(yàn)測(cè)定其致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離毒株對(duì)1日齡雛鴨致死率均為60％，發(fā)病雛鴨自發(fā)病起最快可于十幾分鐘內(nèi)死亡。死后呈典型角弓反張姿勢(shì)。解剖后可見主要病變器官是肝臟。肝臟普遍腫脹，邊緣鈍圓，病變主要為充血、出血，顏色變淡或略帶土黃色，表面斑駁，有針尖大小、瘀斑狀或彌漫性出血。多數(shù)膽囊腫脹，內(nèi)充滿墨綠色膽汁。部分死亡雛鴨腎臟腫大，血管樹枝狀充血。其余臟器無病變或不明顯。ZJD株第5代尿囊液ELD50為10-4.764/0.2ml，Z

3、JM株第5代尿囊液ELD50為10-4.60/0.2ml。分離毒株血凝試驗(yàn)均為陰性。
　　 2.參考GenBank中收錄的Ⅰ型鴨肝炎病毒全基因組序列，利用PrimerPremier5.0、oligo6.0軟件在保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，此引物擴(kuò)增片段包含有VP1結(jié)構(gòu)蛋白全基因組。通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立RT-PCR檢測(cè)方法，該方法能從分離毒株中擴(kuò)增到長(zhǎng)度為1341bp的目的片斷。通過建立的RT-PCR方法鑒定其余6株未能從尿囊液中分離到

4、毒株的尿襄液，另檢測(cè)得到一個(gè)毒株，命名為NX。對(duì)所得到的3個(gè)毒株測(cè)序后進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，分離毒株與GenBank上已發(fā)表的DHVⅠ毒株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分別為91.0％～99.4％和94.5％～99.2％，證實(shí)分離毒株均為Ⅰ型鴨肝炎病毒。分離毒株之間核苷酸和氨基酸同源性分別為93.7％～96.2％和96.6％～97.9％。經(jīng)核苷酸同源性分析可知，分離株ZJD與ZZ株同源性最高，為99.4％，與LY0801同源性最低

5、，為93.1％。NX與NA株同源性最高，為96.6％，與5886株同源性最低，為92.2％。ZJM與NA株同源性最高，為99.3％，與5886株同源性最低，為91.0％。由氨基酸同源性分析可知，分離株ZJD與ZZ株、X株以及GFS99株同源性最高，均為99。2％，與A66同源性最低，為94.5％。NX與NA株同源性最高，為97.9％，與ZJ株同源性最低，為95.0％。ZJM與NA株同源性最高，為99.2％，與ZJ株同源性最低，為95.0

6、％?；赩P1全基因核苷酸序列及氨基酸序列分別建立遺傳進(jìn)化樹譜。結(jié)果表明，ZJD株的VP1基因與山東地區(qū)的SG株、ZZ株的VP1基因的核苷酸處于一個(gè)較小分枝上，親緣關(guān)系最近；NX株與ZJM株的VP1基因處于同一分枝上，且均與福建地區(qū)的NA株的VP1基因處于同一較小分枝上，親緣關(guān)系最近。而ZJD株的VP1基因與161-79-V的氨基酸序列處于較小分枝上；NX株與ZJM株的VP1基因氨基酸序列處于同一分枝上，且均與福建地區(qū)的NA株的VP1基