DEHP對大鼠離體海馬神經(jīng)元樹突和突觸形態(tài)發(fā)育的影響.pdf

1、鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]是典型的一類鄰苯二甲酸酯，是應用廣泛的一種塑化劑，它極易從塑料產(chǎn)品上釋放出來污染生態(tài)環(huán)境，從而使人類和野生動物暴露其中。大量實驗表明，DEHP是一類環(huán)境內分泌干擾物，使機體產(chǎn)生生殖發(fā)育毒性、遺傳毒性和多種器官癌變等損傷，但是目前人們對其神經(jīng)發(fā)育毒性的認識還很少。性激素對神經(jīng)元樹突發(fā)育和突觸發(fā)生起重要作用，并因此影響腦的發(fā)育和功能。由于DEHP

2、具有抗雄激素和擬雌激素的活性，進入機體后可能會干擾性激素的正常生理活性，影響個體的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。本實驗室前期的研究表明，圍生期暴露DEHP會使小鼠產(chǎn)生學習記憶損傷和焦慮抑郁樣的行為，表明DEHP影響動物的神經(jīng)行為發(fā)育。鑒于神經(jīng)元的形態(tài)結構是其活動的基礎，我們推測DEHP可能會影響神經(jīng)元的發(fā)育。
　　在神經(jīng)元發(fā)育的初期，樹突干上生長許多樹突生長錐和樹突絲，之后，樹突絲逐漸被粗而短，形態(tài)相對穩(wěn)定的樹突棘所取代，而90％以上的興奮性突觸

3、發(fā)生于樹突棘。成熟穩(wěn)定的樹突棘是神經(jīng)元間產(chǎn)生突觸聯(lián)系的重要結構基礎。突觸密度大表示神經(jīng)系統(tǒng)的突觸網(wǎng)絡連接非常復雜，且可塑性潛力較大。因此，神經(jīng)元的樹突棘發(fā)育、突觸的建立和神經(jīng)回路的形成就構成了腦發(fā)育的關鍵環(huán)節(jié)。雌激素可與雌激素受體結合，通過激活一系列信號通路或調節(jié)基因的表達，參與調節(jié)樹突發(fā)育和突觸可塑性。突觸部位關鍵蛋白的水平變化直接影響突觸間的傳遞效能。突觸素Ⅰ(SynapsinⅠ)是位于突觸前膜的一種標志性蛋白，細胞外調節(jié)蛋白激酶(

4、extracellular regulated protein kinases，ERK)途徑被激活后，可以使SynapsinⅠ發(fā)生磷酸化，參與調控突觸前神經(jīng)遞質的釋放。PSD95是神經(jīng)元突觸后致密區(qū)的腳手架蛋白，聯(lián)系和錨定N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)、α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體（AMPAR）和下游信號分子于突觸后膜上，這種結構上的緊密聯(lián)系在突觸可塑性中發(fā)揮著重要作用。DEHP是否會通過與雌激素類似的途徑影響樹突和

5、突觸的發(fā)育，我們不得而知。
　　本實驗研究DEHP長時暴露對離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元樹突和突觸發(fā)育的影響，利用雌激素受體阻斷劑ICI182，780和Western blot技術初步探討DEHP長時暴露的分子機制。
　　方法:取新生24 h的健康SD大鼠乳鼠的海馬，體外培養(yǎng)第5天(DIV5)進行DEHP暴露5天。首先，設置對照組(DMSO)、DEHP組（1、10、100nM，1和10μM），探究DEHP的劑量效應。于DIV10對細

6、胞進行免疫熒光染色，觀察神經(jīng)元樹突和突觸的形態(tài)。其次，選取效應極顯著的劑量（1nM或1μM）進一步研究，設置對照組、DEHP組、雌二醇(E2)組、DEHP+E2組，探討DEHP與E2之間的關系;然后，應用雌激素受體阻斷劑ICI182，780探究DEHP是否通過雌激素受體影響神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育。
　　采用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽特異性標記神經(jīng)元纖維型肌動蛋白(F-actin)，在激光共聚焦顯微鏡下檢測樹突絲和樹突棘的密度;采用免疫雙熒光染

7、色分別標記突觸前蛋白SynapsinⅠ和細胞骨架F-actin，由SynapsinⅠ（綠色熒光）和F-actin（紅色熒光）共定位突觸（黃色熒光），統(tǒng)計樹突上突觸的密度。
　　為了進一步探討DEHP影響神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的分子機制，采用western blot方法檢測神經(jīng)元SynapsinⅠ、PSD95和NMDAR亞基NR2B的蛋白水平，分析突觸蛋白和興奮性氨基酸受體亞基的變化;檢測ERK和p-ERK的蛋白表達變化，以探究NMDAR和

8、ERK信號途徑是否參與DEHP長時暴露對神經(jīng)元發(fā)育的影響。
　　結果:1.DEHP(1 nM～10μM)暴露5天，顯著降低海馬神經(jīng)元的樹突絲和樹突棘密度(P＜0.05，P＜0.01)，效應曲線呈“U”型，提示DEHP抑制神經(jīng)元樹突的發(fā)育;與E2組相比，（1nM或1μM）DEHP+E2組顯著抑制樹突絲和樹突棘密度(P＜0.01)，提示DEHP與雌激素共同作用表現(xiàn)出拮抗的效應;DEHP+ICI組和DEHP組相比較，樹突絲和樹突棘的密度

9、顯著上調(P＜0.01)，但是DEHP+ICI組與ICI組存在顯著差異(P＜0.01)，暗示雌激素受體阻斷劑部分消除DEHP的抑制作用，推測雌激素受體參與DEHP對神經(jīng)元樹突發(fā)育的抑制效應。
　　2.(1 nM～10μM)DEHP暴露5天顯著降低海馬神經(jīng)元突觸密度(P＜0.01)，10 nM DEHP對突觸密度的影響無顯著差異，效應曲線呈“U”型，提示DEHP抑制神經(jīng)元突觸的發(fā)育;（1nM或1μM）DEHP顯著抑制E2對樹突絲和樹

10、突棘密度的促進作用(P＜0.01)，提示DEHP與雌激素共同作用時表現(xiàn)出拮抗效應;DEHP+ICI組和DEHP組相比，突觸的密度顯著上調(P＜0.01)，而DEHP+ICI組與ICI組仍差異顯著(P＜0.01)，提示雌激素受體阻斷劑可以部分解除DEHP的抑制效應，推測雌激素受體可能參與其對突觸發(fā)育的不利作用。
　　3.Western blot分析結果發(fā)現(xiàn)，DEHP（1nM和1μM）長時暴露5天顯著下調NMDAR亞基NR2B（P＜0

11、.05或P＜0.01）及突觸蛋白SynapsinⅠ(P＜0.01或P＜0.01)和PSD95（P＜0.01或P＜0.01）的表達水平，顯著降低p-ERK的活性（P＜0.01或P＜0.01）。
　　結論:DEHP長時暴露顯著下調體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元樹突絲、樹突棘和突觸密度;同時降低突觸蛋白SynapsinⅠ和PSD95的表達水平，使NMDAR亞基NR2B表達下調，p-ERK的活性降低，提示DEHP長時暴露抑制海馬神經(jīng)元的樹突和突