雄激素對急性海馬腦片神經(jīng)元樹突棘和突觸蛋白的快速作用.pdf

1、目的：本課題以急性海馬腦片神經(jīng)元作為研究對象，觀察睪酮（T）、雙氫睪酮（DHT）和睪酮-牛血清白蛋白（T-BSA）對急性海馬腦片神經(jīng)元樹突棘密度及突觸蛋白SYN和PSD95的快速作用，探討雄激素非基因組效應(yīng)對海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)可塑性的影響。
　　方法：
　　1.急性海馬腦片的制備和神經(jīng)元活性鑒定。SD大鼠麻醉后，斷頭取腦，置于人工腦脊液（ACSF）中。剝離并修整海馬組織，振動切片機(jī)制備300μm的冠狀海馬腦片，置于ACSF中

2、孵育。每只大鼠制備5片急性海馬腦片，分別在0 min、15 min、30 min、60 min和120 min5個時間點轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞核染料DAPI和PI的ACSF中孵育，清洗多余熒光染料后，裱片于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)，通過熒光染料的染色情況鑒定急性腦片海馬神經(jīng)元的活性。
　　2.雄激素對急性海馬腦片神經(jīng)元樹突棘密度的快速影響。制備急性海馬腦片。隨機(jī)分為對照組（CON組）、T組、DHT組和T-BSA組。根

3、據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實驗結(jié)果，T組和DHT組藥物作用濃度為10 nM，T-BSA組為0.36 nM，CON組給予等量的二甲基亞砜。根據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實驗結(jié)果，藥物作用時間為1 h。給藥結(jié)束后，4％多聚甲醛固定，進(jìn)行Golgi-Cox染色。激光共聚焦顯微鏡對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元頂樹突第2級或第3級樹突的樹突棘成像，通過Imaris軟件計算所選樹突上的樹突棘密度，進(jìn)行各組樹突棘密度間的比較。
　　3.雄激素對急性海馬腦片神經(jīng)元突觸蛋白 SYN和

4、 PSD95的快速影響。制備急性海馬腦片。實驗分組以及藥物作用濃度和作用時間同上一部分。給藥結(jié)束后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液脫水處理，包埋后進(jìn)行冰凍切片，取每個腦片固定表面深度的三張切片，切片厚度10μm，裱片于載玻片上。應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)染色方法，激光共聚焦顯微鏡對海馬CA1區(qū)突觸蛋白SYN和PSD95進(jìn)行觀察并比較各組平均相對熒光強(qiáng)度。
　　結(jié)果：
　　1.急性海馬腦片的制備和神經(jīng)元活性鑒定的結(jié)果。制備的急性海

5、馬腦片肉眼觀察為淡黃色，舒展平整。選擇表層下層面的細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞邊界清晰且折光性好，立體感及層次感較強(qiáng)，細(xì)胞核和顆粒均不可見。在細(xì)胞核染料DAPI和PI雙重染色顯示，急性海馬腦片神經(jīng)元在0 min、15 min、30 min、60 min、120 min5個時間點，活細(xì)胞百分比分別為79.92±1.66％、80.06±0.94％、80.60±0.97％、79.48±0.92％和79.87±0.88％，各組之間神經(jīng)元活性

6、無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.雄激素對急性海馬腦片神經(jīng)元樹突棘密度快速影響的結(jié)果。Golgi-Cox染色結(jié)果顯示：與CON組（2.10±0.15 thorns/μm）相比， T組（2.89±0.19 thorns/μm）、DHT組（3.01±0.16 thorns/μm）和T-BSA組（2.90±0.22 thorns/μm）的樹突棘密度均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；T組、DHT組和T-BSA組之間樹突棘密度無統(tǒng)計學(xué)差異。
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7、.雄激素對急性海馬腦片神經(jīng)元突觸蛋白SYN和PSD95快速影響的結(jié)果。SYN免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：與CON組（42.26±3.66）相比，T組（54.22±4.10）、DHT組（56.01±4.90）和T-BSA組（55.34±6.12）的平均相對熒光強(qiáng)度均有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；T組、DHT組和T-BSA組之間SYN平均相對熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異。PSD95免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：與CON組（70.26±4.55）相

8、比，T組（84.12±5.34）、DHT組（83.98±3.37）和T-BSA組（85.84±4.45）的平均相對熒光強(qiáng)度均有明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；T組、DHT組和T-BSA組之間PSD95平均相對熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.實驗條件下制備的急性海馬腦片神經(jīng)元在2 h內(nèi)細(xì)胞活性穩(wěn)定良好。
　　2.雄激素在短時間內(nèi)快速增加了急性海馬腦片神經(jīng)元樹突棘密度。
　　3.雄激素在短時間內(nèi)快速增加了急性