大豆轉(zhuǎn)HarpinXooc蛋白編碼基因(hrf2)及其在后代中的遺傳表達(dá)研究.pdf

1、革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌可以產(chǎn)生非寄主?；约ぐl(fā)子Harpin，該激發(fā)子可以激發(fā)煙草的過敏性細(xì)胞壞死反應(yīng)(hypersensitive cell death，HCD)。Harpin類激發(fā)子的生化特征都十分相似:富含甘氨酸(Gly)，不含半胱氨酸(Cys)，熱穩(wěn)定性，對(duì)蛋白酶敏感，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病、蟲性，并促進(jìn)植物生長。研究發(fā)現(xiàn)，植物經(jīng)Harpin蛋白處理過后可對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲等產(chǎn)生抗性，其生長也會(huì)受到不同程度的促進(jìn);若Harpi

2、n蛋白編碼基因通過基因工程導(dǎo)入到煙草、馬鈴薯、油菜等植物中，可以不同程度地提高轉(zhuǎn)基因植株的抗性和產(chǎn)量。
　　hrf2基因來源于水稻細(xì)條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）菌株RS105，該基因片段大小為414 bp，HarpinXooc為其編碼產(chǎn)物，含有138個(gè)氨基酸，分子量約為15.3×103，HarpinXooc的特征和功能與其他Harpin蛋白極其類似。在本研究中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將hrf

3、2基因轉(zhuǎn)入到大豆，以期獲得抗病性提高和性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因大豆。
　　本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以子葉節(jié)為外植體，將重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3300∷hrf2（含有目的基因hrf2）轉(zhuǎn)入到大豆天隆1號(hào)中，共獲得了115株抗性再生植株（T0代）。經(jīng)過表型篩選、bar試紙條檢測(cè)、PCR和RT-PCR檢測(cè)等證明有41株含有目的基因hrf2。將轉(zhuǎn)基因大豆自花授粉得到的種子種在田間作為T1代，通過對(duì)T1代進(jìn)行表型篩選、bar試紙條檢測(cè)、PC

4、R、RT-PCR以及Western-blot檢測(cè)，來研究hrf2基因在T1代轉(zhuǎn)基因大豆中的遺傳表達(dá)情況。結(jié)果表明，hrf2基因已整合到大豆基因組中并能在轉(zhuǎn)錄水平上正常表達(dá)以及目的基因編碼蛋白（HarpinXooc）能夠在T1代轉(zhuǎn)基因大豆中正常表達(dá)。
　　對(duì)來自于T0-1，T0-2，T0-3，T0-4，T0-5和T0-6這6個(gè)株系的所有T1代轉(zhuǎn)基因植株（41株），進(jìn)行表型篩選和一系列的分子檢測(cè)，卡方分析等，來進(jìn)一步研究抗草丁膦基因（

5、bar）在T1代轉(zhuǎn)基因植株中的遺傳分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):bar基因在T1代轉(zhuǎn)基因植株中的遺傳分離比接近3∶1，符合孟德爾單基因遺傳分離定律?？赏茰y(cè)出bar基因在大豆基因組中是單拷貝插入的。
　　對(duì)PCR呈陽性的T1轉(zhuǎn)基因植株采用離體葉片接種和下胚軸接種法，來研究轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大豆疫霉的抗性情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):離體葉片接種中，T1代轉(zhuǎn)基因植株T17-1，T17-3，T112-1，T119-1和T119-2的葉片病斑直徑顯著小于陰性對(duì)照植株，

6、陰性對(duì)照的病斑直徑約為2.00 cm，而轉(zhuǎn)基因植株的病斑直徑范圍在0.21-1.69 cm之間;下胚軸接種實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照植株的接種處病菌深入擴(kuò)展到髓部，并出現(xiàn)倒伏現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因植株雖然也出現(xiàn)了病斑擴(kuò)展，但不影響其正常生長，但不同轉(zhuǎn)基因植株之間病斑擴(kuò)展的程度不同。兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明了T1代轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)大豆疫霉有顯著的抗性。
　　對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片進(jìn)行室內(nèi)抗大豆蚜蟲檢測(cè)，來研究轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大豆蚜蟲的抗性情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn);與對(duì)

7、照相比，有的轉(zhuǎn)基因植株葉片上的蚜蟲數(shù)從第6d開始顯著減少，有的卻和對(duì)照沒有明顯的差異，表明T1代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大豆蚜蟲具有一定的抗性，且不同植株在不同時(shí)間的抗蟲性不同。
　　對(duì)田間T1-1，T1-2，T1-3，T1-4，T1-5和T1-6等6個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析，來研究外源目的基因（hrf2）對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在自然條件下，轉(zhuǎn)基因植株均可以正常生長發(fā)育，且與陰性對(duì)照相比，莖基部直徑顯著增