大腸桿菌K88可視化快速檢測方法的研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起發(fā)展中國家嬰幼兒、旅游者以及幼畜等急性腹瀉的常見病原菌，E. coli K88可通過飲用受污染的水或進(jìn)食未熟透的食物而感染，引起食源性疾病。隨著病原微生物引起的食品安全問題凸顯，致病菌的檢測技術(shù)尤其是快速檢測技術(shù)作為保障食品安全的重要技術(shù)支撐，在食品生產(chǎn)、流通全過程控制和監(jiān)管以及進(jìn)出口貿(mào)易中發(fā)揮著越來越重要的作用。因此，E. coli K

2、88等病原微生物的準(zhǔn)確、靈敏、簡便快速檢測方法的研發(fā)極其重要。
　　本研究首先采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金，優(yōu)化納米金的制備條件及其表征。結(jié)果表明：采用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器加熱，在200 r/min的攪拌速度下，加入還原劑后繼續(xù)加熱20 min，制備的納米金平均直徑為16.0±0.70 nm，所制備的納米金的濃度為3.57×10-9 mol/L。納米金的貯存穩(wěn)定性評(píng)價(jià)顯示在4℃下避光貯存50 d幾乎不發(fā)生聚集、沉淀等現(xiàn)象。最

3、后通過Au-S鍵對(duì)納米金進(jìn)行修飾，連接上巰基化E. coli K88適配體，為下一步基于納米金和適配體的E. coli K88可視化檢測技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　其次，本研究建立了一種基于金標(biāo)銀染結(jié)合適配體技術(shù)的E. coli K88可視化快速檢測方法，通過對(duì)該快速檢測方法的檢測條件優(yōu)化，確立了鏈酶親和素包被微孔的最佳濃度為0.1mg/mL，生物素化適配體1和巰基化適配體2的最佳工作濃度均為1.0×10-6 mol/L，適配體1

4、、納米金-適配體2復(fù)合物與E. coli K88菌株結(jié)合的最佳條件為40℃下反應(yīng)50 min，銀染增強(qiáng)顯色最佳時(shí)間150 s，顯色結(jié)果肉眼可觀察。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，定量檢測1.0×101~1.0×105 cfu/孔范圍內(nèi)的E. coli K88，其擬合線性曲線指數(shù)R2=0.9903，檢測靈敏度可達(dá)10 cfu/孔，檢測時(shí)間約2 h，而對(duì)其它常見細(xì)菌的檢測為陰性，表明此方法具有特異、可定量的優(yōu)點(diǎn)。
　　最后通過運(yùn)用建立的E. co

5、li K88快速檢測方法，對(duì)人工模擬污染了E. coli K88后的牛奶、豬肉（豬瘦肉和五花肉）以及生食蔬菜（紫甘藍(lán)和生菜）等三類食品樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明該快速檢測方法在該三類食品樣品中的檢測靈敏度相當(dāng)，均為102 cfu/mL（或cfu/g），檢測時(shí)間2 h左右，同時(shí)在1.0×102~1.0×105 cfu/mL(or cfu/g)的E. coli K88污染濃度范圍內(nèi)，三類食品檢測吸光值能與樣品污染濃度對(duì)數(shù)值可以擬合成良好的線性關(guān)