CPT誘導(dǎo)人外周血源破骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor Necrosis factor-related apoptosis- inducing ligand，TRAIL）是腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis factor，TNF）超家族新成員。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)多種組織來源的腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常組織細(xì)胞幾乎沒有影響。但有關(guān)TRAIL對破骨細(xì)胞作用的研究報道并不多見。繼往的研究已證實(shí)環(huán)化變構(gòu)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Circular

2、 Permuted TRAIL,CPT；北京沙東生物技術(shù)有限公司研發(fā)）可以較TRAIL更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們研究CPT對人外周血來源的破骨細(xì)胞的作用，在mRNA水平分析化療藥作用后其兩種CPT死亡受體和兩種誘騙受體表達(dá)的變化，探討CPT對破骨細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床骨髓瘤骨病等的治療新的治療方法和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.人外周血來源破骨細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)
　　采取健康人外周血10ml，共6人份。淋巴細(xì)胞分離液無

3、菌分離PBMC，接種24孔板，接種密度分別為5×105、1×106、2×106細(xì)胞/每孔，加入含30ng/ml M-CSF+30ng/ml RANKL培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)21天形成貼壁、胞體較大形狀不規(guī)則且多核（大于等于3個核）的細(xì)胞。
　　2.破骨細(xì)胞的鑒定
　　2.1 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)試劑盒染色，多個核（大于等于三個核）、胞體較大、酒紅色細(xì)胞

4、為成熟破骨細(xì)胞。取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的預(yù)置爬片，按照TRAP染色步驟進(jìn)行染色。用顯微鏡（100×）普通光照下觀察并拍照。每次取4個孔，隨機(jī)選取10個視野計數(shù)3個核以上的破骨細(xì)胞。
　　2.2 掃描電子顯微鏡觀察破骨細(xì)胞作用于牛皮質(zhì)骨片后形成的骨吸收陷窩。
　　3.CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡
　　3.1 不同濃度CPT對破骨細(xì)胞作用，CPT藥物濃度分別為0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml，作用24小時、48

5、小時后進(jìn)行TRAP染色，倒置顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞形態(tài)變化。
　　3.2 Annexin V–FITC熒光染色法檢測CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡：將CPT0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml處理后的破骨細(xì)胞在 Annexin V–FITC熒光染色劑中37℃孵育15分鐘，熒光顯微鏡下觀察凋亡的破骨細(xì)胞。
　　4.RT-PCR法檢測破骨細(xì)胞中 CPT受體 mRNA表達(dá)變化的影響以0ng/ml、100ng/ml、500ng/m

6、lCPT處理破骨細(xì)胞24h、48h后，實(shí)時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）法檢測DR4、DR5、DcR1及DcR2 mRNA水平表達(dá)變化，分析其與CPT誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。
　　5.統(tǒng)計學(xué)：應(yīng)用 SPSS19.0(SPSS Inc,USA)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析，統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。大寫字母代表著差異性

7、極顯著（P<0.01）；小寫字母代表著差異性顯著（P<0.05）。
　　結(jié)果：
　　1.外周血單個核細(xì)胞經(jīng)M-CSF及RANKL誘導(dǎo)21天后顯微鏡下可見到大量成熟的破骨細(xì)胞，其形態(tài)學(xué)特征為：細(xì)胞體積較大，細(xì)胞漿豐富呈酒紅色，多核，細(xì)胞核≥3個，甚至多達(dá)數(shù)十個。該細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色呈現(xiàn)陽性（酒紅色），進(jìn)行骨片吸收實(shí)驗(yàn)顯示其較強(qiáng)的骨吸收活性。證實(shí)可以經(jīng) PBMC誘導(dǎo)形成具有骨吸收活性的破骨細(xì)胞。在相同的培養(yǎng)條件下PBMC細(xì)胞在

8、2×106個/ml接種密度下，誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量為50.2±11.6/HPF，于5×105個/ml誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量18.0±6.37/HPF及1×106個/ml誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量36.4±9.54/HPF相比，誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量最多。
　　2.CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，顯微鏡下觀察到CPT作用24小時后破骨細(xì)胞出現(xiàn)空泡化、變形，48h后破骨細(xì)胞的封閉帶出現(xiàn)破裂或者消失等凋亡特征。
　　3.CPT誘導(dǎo)

9、破骨細(xì)胞早期凋亡凋亡Annexin V–FITC熒光染色，熒光顯微鏡下觀察到不同濃度 CPT作用于破骨細(xì)胞后典型的早期凋亡特征，CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)一定的時間-濃度依賴性。
　　4.CPT對破骨細(xì)胞CPT相關(guān)受體mRNA表達(dá)的影響：DR4、DR5、DcR1及 DcR2在破骨細(xì)胞上均有表達(dá)。經(jīng)100ng/ml、500ng/mlCPT處理破骨細(xì)胞24h，CPT的相關(guān)受體DR4、DR5、DcR1及DcR2的mRNA表達(dá)水平變化不顯

10、著（P>0.05）；處理48h后， DR4和DcR2的mRNA表達(dá)水平仍無顯著變化（P>0.05），DR5及DcR1的mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05或P<0.01）。推斷CPT是通過DR5誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.可以由人PBMC誘導(dǎo)形成的具有骨吸收活性的破骨細(xì)胞。
　　2.CPT可誘導(dǎo)人外周血源的破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡。其誘導(dǎo)作用呈時間及濃度依賴性。
　　3.CPT作用破骨細(xì)胞一定時間后可降低DR5