NGF及CGRP對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CREB表達和tau蛋白磷酸化的影響.pdf

1、本文研究目的：NGF及CGRP對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CREB表達和tau蛋白磷酸化的影響。 實驗方法： 1、實驗動物的分組。健康雄性Wistar大鼠146只，隨機分為5組：(1)假手術對照組(Sham組，n=31)；(2)缺血再灌注模型組(I/R組，n=31)；(3)NGF處理組(n=28)；(4)CGRP處理組(n=28)；(5)NGF&CGRP合用組(n=28)。各組又分假手術后或再灌注3h、12h、24h、4

2、8h、72h 5個時間點。 2、局灶性腦缺血再灌注模型的制備。采用線栓法阻塞大鼠右側大腦中動脈制作腦缺血再灌注模型，動物清醒后按Longa法進行神經功能評分，本研究選取1、2、3分者作為成功模型。缺血2小時后輕輕拔出栓線以實現再灌注。I/R組、NGF組、CGRP組、NGF＆CGRP組在再灌注同時用微量注射泵從右頸總動脈分別注入1ml的生理鹽水、NGF(1000U/Kg，)、CGRP(3μg/kg)、NGF＆CGRP(NGF，10

3、00u/kg；CGRP 3μg/kg)，：速度2 ml/h。 3、TTC染色假手術組與I/R組大鼠于24 h時間點隨機各取3只，斷頭取腦作冠狀切片，放于TTC溶液中染色，后固定，拍照。 4、組織切片的準備以上各組動物分別于再灌注不同時間點，用多聚甲醛灌注固定，取腦，作連續(xù)腦冠狀冰凍切片。 5、HIE染色觀察海馬組織病理學變化大鼠腦切片行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察比較各組大鼠再灌注24 h的海馬組織病理學變化。

4、 6、Nissl染色，計數右側海馬CA1區(qū)每個視野下神經元數目。 7、采用CREB、tau原位雜交檢測試劑盒檢測切片CREB mRNA、tau mRNA的表達。 8、免疫組織化學染色檢測CREB與p-CREB表達。 9、免疫組織化學染色檢測p-tau(Ser199/202)與tau-5表達。 10、原位雜交和免疫組織化學切片圖像分析與統(tǒng)計學處理。 定量分析各組大鼠右側海馬CA1區(qū)CREB mRN

5、A、CREB蛋白和p-CREB以及tau mRNA、p-tau(Ser199/202)和tau-5陽性反應物的平均光密度值，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件作統(tǒng)計分析，樣本均數間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 11、Westem blot檢測海馬CREB和p-CREB的表達、圖像分析及數據處理。 12、Westem blot檢測海馬p-tau(Ser199/202)與tau-5的表達、圖像分析及數據處理。

6、 實驗結果： 1、動物行為學觀察按Longa法神經功能評分為1～3分的動物表現有明顯神經功能受損癥狀，假手術動物評分為0分。 2、TTC染色結果TTC染色發(fā)現缺血再灌注組右紋狀體外側及皮質外側有明顯的缺血灶，該區(qū)域為大腦中動脈供血區(qū)，假手術動物腦無缺血灶，證明模型制作成功。 3、切片組織病理學觀察與Nissl染色細胞計數HE和Nissl染色可見假手術組右側海馬結構清晰，CA1區(qū)神經元數量多，胞漿中尼氏體清晰可

7、見。在缺血再灌注24 h組，右側海馬CA1區(qū)神經元中出現了一些缺血樣改變，正常神經元數量減少。NGF組、CGRP組海馬CA1區(qū)存活神經元數比缺血再灌注組增多，細胞形態(tài)明顯改善，NGF與CGRP合用組海馬CA1區(qū)存活神經元數進一步增多。 4、CREB原位雜交染色及定量分析結果假手術組海馬CA1區(qū)CREB mRNA有明顯表達，缺血再灌注組CA1區(qū)CREBmRNA陽性反應產物平均光密度值低于假手術組，NGF組和CGRP組的CREBmR

8、NA表達高于缺血再灌注組，NGF＆CGRP組CREB mRNA表達分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 5、CREB和p-CREB免疫組化染色及定量分析結果假手術組海馬CA1區(qū)CREB有明顯表達，缺血再灌注組CA1區(qū)CREB陽性反應產物平均光密度值低于假手術組，NGF組和CGRP組的CREB表達均高于缺血再灌注組，NGF&CGRP組的CREB陽性反應產物分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 Sham組

9、CA1區(qū)P-CREB表達較少，I/R組P-CREB的表達明顯高于sham組，NGF組和CGRP組CA1區(qū)P-CREB的平均光密度值均大于I/R組和sham組，NGF&CGRP組P-CREB表達分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 6、Western blot檢測海馬CREB和P-CREB的表達結果Western印跡顯示在相對分子量43kD處I/R組CREB的積分光密度值(IDV值)比sham組小，而NGF組和CGRP組

10、海馬CREB的IDV值高于I/R組，NGF&CGRP合用組CREB表達進一步升高(P<0.05)。I/R組p-CREB的IDV值高于sham組，NGF組和CGRP組P-CREB的IDV值均高于Sham組和I/R組，NGF&CGRP組P-CREB表達最高，分別高于NGF組和CGRP組(P<0.05)。 7、P-tau(Ser199/202)和tau-5免疫組化染色及定量分析結果p-tau在Sham組有表達，在缺血再灌注3 h明顯增

11、加，到12h、24h進一步升高后逐漸下降，到72 h仍高于對照組水平(P<0.05)；NGF及CGRP明顯降低缺血再灌注海馬神經元的p-tau(Ser199/202)免疫反應性，NGF與CGRP合用進一步降低缺血再灌注海馬神經元p-tau(Ser199/202)表達(P<0.05)。缺血再灌注組tau-5陽性神經元的平均光密度在各時點均高于假手術組；NGF組和CGRP組tau-5反應陽性產物的平均光密度值均低于缺血再灌注組(P<0.05

12、)，NGF與CGRP合用明顯降低缺血再灌注海馬tau=5反應性，但與單獨使用NGF或CGRP組相比，差異無顯著性。 8、Western blot檢測海馬p-tau(Ser199/202)和tau-5的表達結果缺血再灌注組p-tau免疫印跡IDV值較假手術組增高；NGF組和CGRP組p-tau條帶光密度值比缺血再灌注組減少，但高于假手術組；NGF與CGRP合用組p-tau條帶光密度值進一步降低，分別低于I/R組和NGF、CGRP組

13、(P<0.05)。tau-5在I/R．組表達增多，NGF、CGRP處理后tau-5表達減少，低于缺血再灌注模型組(P<0.05)，NGF與CGRP合用處理后海馬tau-5表達比缺血再灌注模型組減少，但與NGF組、CGRP組比較無明顯變化。 9、tau．原位雜交染色結果tau mRNA陽性反應產物呈棕黃色，多位于胞漿，細胞核也有著色，各組大鼠海馬CA1區(qū)tau mRNA均有明顯表達，且表達的強弱相近，無明顯變化。 研究結論：

14、 1、NGF及CGRP改善局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬神經元形態(tài)，二者促進缺血神經元的恢復可能是通過上調海馬神經元內CREB mRNA及其蛋白的表達、激活CREB來實現的，激活CREB可能是NGF及CGRP保護缺血神經元的重要分子機制之一。 2、NGF及CGRP減輕局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬tau蛋白磷酸化程度，并下調tau．5蛋白的表達，而對tau mRNA影響不大，抑制tau蛋白磷酸化水平可能是NGF及CGRP保護缺血神經元