五氯酚對(duì)稀有鮈鯽卵黃蛋白原和熱應(yīng)激蛋白誘導(dǎo)效應(yīng)的研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors,EEDs)能夠通過干擾正常機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)從而影響生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等生命活動(dòng),已成為關(guān)系到人類生存和繁衍的熱點(diǎn)問題.五氯酚(Pentachlorophenol,PCP)屬于優(yōu)先檢測(cè)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一.它作為一種高效廉價(jià)的殺蟲劑、木材防腐劑及除草劑曾在世界范圍內(nèi)廣泛使用.其在中國(guó)長(zhǎng)江中下游11個(gè)省、市、自治區(qū)被大范圍、長(zhǎng)時(shí)間地用作殺滅釘螺和控

2、制血吸蟲病,最終進(jìn)入水體生態(tài)系統(tǒng)對(duì)水環(huán)境造成持久性污染.PCP具有較強(qiáng)的致癌、致畸、致突變作用,對(duì)生物體的生殖系統(tǒng)影響較大.PCP對(duì)生物體的內(nèi)分泌干擾作用日益明顯,但對(duì)其雌激素效應(yīng)一直存在異議,且PCP內(nèi)分泌干擾作用具體的分子機(jī)制及其可供檢測(cè)的敏感分子生物標(biāo)志物研究均較少.稀有絢鯽為中國(guó)所特有的水生模式生物,與斑馬魚等相比具有更好的敏感性和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性,是進(jìn)行化學(xué)品毒性測(cè)試和環(huán)境水樣毒性實(shí)驗(yàn)的理想材料.因此,本研究選擇稀有鮈鯽為研究對(duì)象,

3、采用水體暴露的方式,分別從組織、蛋白、基因水平研究PCP對(duì)其卵黃蛋白原的誘導(dǎo)效應(yīng)以徹底揭示PCP的雌激素效應(yīng)及其作用機(jī)制;同時(shí)通過研究PCP對(duì)稀有鮈鯽熱應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)效應(yīng)以篩選敏感、準(zhǔn)確的分子生物標(biāo)志物,對(duì)PCP進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè).研究?jī)?nèi)容主要包括以下部分:
　　 1.為研究VTG在稀有鮈鯽不同組織器官的表達(dá)分布情況,以及PCP暴露對(duì)不同組織中VTG表達(dá)分布的誘導(dǎo)作用,采用半靜態(tài)水體暴露的方法,將成年雌、雄稀有鮈鯽及幼魚分別暴露于空

4、白對(duì)照組,DMSO溶劑對(duì)照組.16、80、160μg·L-1 PCP處理組,50 ng·L-1 EE2陽性對(duì)照組中14、21、28 d.先利用免疫組化法檢測(cè)空白對(duì)照組中稀有鮈鯽幼魚和雌、雄魚體內(nèi)肝臟、腎臟、脾臟、腸、性腺、大腦、肌肉組織中VTG蛋白的表達(dá)分布情況,研究發(fā)現(xiàn)VTG蛋白在稀有鮈鯽肝臟細(xì)胞中合成,通過血液循環(huán)到達(dá)其他組織;VTG蛋白只在稀有鮈鯽雌魚肝臟、腎臟、脾臟、腸組織中有分布,而在其幼魚和雄魚各組織中均未見分布.再利用免疫

5、組化檢測(cè)PCP和EE2暴露對(duì)稀有觴鯽幼魚和雄魚肝臟、腎臟、脾臟、腸、性腺、大腦、肌肉組織中VTG的誘導(dǎo)表達(dá)情況,研究發(fā)現(xiàn)PCP和EE2暴露均能誘導(dǎo)雄魚和幼魚肝臟、腎臟、脾臟、腸組織中出現(xiàn)VTG蛋白分布,但PCP效應(yīng)遠(yuǎn)弱于EE2,并且其肝臟組織中VTG蛋白的分布與PCP暴露呈濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).結(jié)果表明稀有鮈鯽幼魚及雄魚各組織中VTG的非正常表達(dá)分布可以應(yīng)用于環(huán)境雌激素的檢測(cè),從組織水平驗(yàn)證了PCP具有雌激素效應(yīng).
　　 2.采用

6、肝臟組織勻漿和收集血清兩種方法結(jié)合ELISA技術(shù)準(zhǔn)確檢測(cè)不同濃度PCP暴露對(duì)雌雄稀有鮈鯽VTG蛋白的誘導(dǎo)量.研究發(fā)現(xiàn)40、80、120、160μg·L-1 PCP暴露21 d能夠顯著誘導(dǎo)雌雄稀有觴鯽肝臟和血清中VTG蛋白含量,并具有顯著濃度效應(yīng)(P＜0.01).結(jié)果表明稀有觴鯽肝臟組織勻漿結(jié)合ELISA方法同樣可以準(zhǔn)確檢測(cè)PCP的雌激素效應(yīng).稀有鮈鯽VTG蛋白可以作為PCP檢測(cè)的分子生物標(biāo)志物,從蛋白水平說明PCP具有雌激素效應(yīng).

7、>　　 3.為了解PCP雌激素作用的機(jī)制,利用Real-time PCR檢測(cè)8、16、80、160μg·L-1 PCP暴露21 d對(duì)稀有鮈鯽雄魚和幼魚肝臟中雌激素相關(guān)關(guān)鍵基因(Erα、ERB1、ERβ2、VTGⅠ、VTGⅡ)表達(dá)的影響.研究發(fā)現(xiàn),不同濃度PCP均能抑制稀有鮈鯽雄魚和幼魚肝臟中Erα基因mRNA的表達(dá)(P＜0.05),但誘導(dǎo)ERβ1、ERβ2基因mRNA的表達(dá)(P＜0.05);但EE2具有相反的作用,它誘導(dǎo)稀有鮈鯽雄魚和

8、幼魚肝臟中Erα基因mRNA的表達(dá)(P＜0.01),但抑制ERβ1、ERβ2基因mRNA的表達(dá)(P＜0.01).同時(shí)PCP和EE2都顯著誘導(dǎo)VTGⅠ、VTGⅡ基因mRNA的表達(dá)(P＜0.01),但PCP作用遠(yuǎn)弱于EE2.說明PCP和EE2可能通過調(diào)節(jié)不同ER基因的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)VTG基因的表達(dá)發(fā)揮雌激素效應(yīng),從基因水平揭示PCP具有雌激素效應(yīng).
　　 4.利用簡(jiǎn)并引物和RT-PCR技術(shù)從稀有鮈鯽肝臟中克隆得到HSP70和HSP9

9、0基因序列片段.HSP70基因片段為1783 bp,編碼594個(gè)氨基酸,提交Genbank得到序列號(hào)為:HQ897964;HSP90基因片段為1995 bp,編碼665個(gè)氨基酸,提交Genbank得到序列登錄號(hào)為:HQ897964.對(duì)稀有鮈鯽HSP70和HSP90基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們均具有高度保守性;建立系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)它們與金絲魚親緣關(guān)系最近.進(jìn)行組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽HSP70在各組織中均有分布且在鰓和心臟組織中表達(dá)量最

10、高,而HSP90基因在除鰭以外組織都有分布,在肝臟組織中表達(dá)量最高.稀有鮈鯽HSP70和HSP90基因的克隆為其作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露應(yīng)激的分子生物標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ).
　　 5.利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度PCP暴露不同時(shí)間對(duì)稀有鮈鯽肝臟中HSP70和HSP90基因表達(dá)的影響.研究發(fā)現(xiàn)PCP可以顯著誘導(dǎo)稀有鮈鯽HSP70和HSP90基因mRNA的表達(dá),并具有濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng).8、16、80、160μg·L

11、-1 PCP暴露7 d,HSP70基因誘導(dǎo)表達(dá)隨PCP濃度增加而增加,回歸方程為:y=0.0408x+1.6692;HSP90基因的誘導(dǎo)表達(dá)隨著PCP暴露濃度的增加先上升后下降,回歸方程為:y=-0.0002x2+0.0311x+1.1563.80μg·L-1 PCP暴露0.5、1、3、5、7 d,HSP70基因的誘導(dǎo)表達(dá)隨著PCP暴露時(shí)間的增加而增加,回歸方程為:y=0.721x+1.1606;HSP90基因的誘導(dǎo)表達(dá)隨著PCP暴露時(shí)