卵黃蛋白原的純化與檢測及其在己烯雌酚和炔雌醇聯(lián)合毒性研究中的應(yīng)用.pdf

1、卵黃蛋白原(Vitellogenin，Vtg)是卵生動物中卵黃蛋白的前體，通常只存在于性成熟的雌性個體中。但是如果雄性或幼體暴露于環(huán)境雌激素環(huán)境，其體內(nèi)也能產(chǎn)生Vtg。因此，Vtg被認(rèn)為是一種理想的環(huán)境雌激素蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，在研究各種化合物的雌激素效應(yīng)中被廣泛應(yīng)用。 Vtg的純化多采用離子交換與凝膠滲透兩步驟法，耗時長，回收率低、Vtg容易降解。因此，有必要開發(fā)一種簡單、快速、回收率高的Vtg純化方法。目前Vtg的檢測主要采

2、用特異性的免疫分析方法，方法靈敏，選擇性強；但耗時長，操作繁瑣。建立快速、簡便、可靠的Vtg檢測方法成為深入開展Vtg作為環(huán)境雌激素標(biāo)志物研究的關(guān)鍵前提。在環(huán)境雌激素毒性研究方面，大多數(shù)研究僅針對單一環(huán)境雌激素的毒性效應(yīng)展開，而對多種雌激素的復(fù)合污染和聯(lián)合效應(yīng)的研究較少。隨著我國沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，大量污染物被排入大海，沿海及河口地區(qū)的污染日益加劇，開展持久性強、毒性大的環(huán)境雌激素對近海海洋生物聯(lián)合效應(yīng)的研究，因而具有重要意義。

3、 本研究將離子交換色譜和超濾離心技術(shù)相結(jié)合，建立了兩級純化Vtg的新方法；將內(nèi)源熒光法與紫外分光法相結(jié)合，建立了靈敏度高、線性范圍廣、操作簡單的Vtg測定新方法；并在建立分離檢測手段的基礎(chǔ)上，利用Vtg為主要觀察指標(biāo)，開展己烯雌酚(DES)和炔雌醇(EE2)聯(lián)合作用研究。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果包括以下幾個方面： 1．卵黃蛋白原的兩級純化與初步鑒定 采用17β—雌二醇(E2)腹腔注射的方式誘導(dǎo)真鯛(Pagrosomus

4、 major)產(chǎn)生大量Vtg，利用弱陰離子交換和超濾兩級純化的方法，快速、可靠地獲得了純度和濃度較高、鹽度較低的Vtg實驗室標(biāo)樣。整個純化過程省時簡便。兩級純化得到的Vtg的色譜、電泳行為及分子量與文獻(xiàn)報道的基本一致。 2．內(nèi)源熒光法與紫外分光法串聯(lián)測定魚血清中的Vtg 利用Mini Q高分辨離子交換色譜柱對魚血清樣品進(jìn)行分離，采用紫外分光法和內(nèi)源熒光法同時測定Vtg，建立了一種線性范圍寬、靈敏度高、操作簡單的測定方法。

5、紫外分光法測定Vtg的線性范圍為24.1—96.4μg/mL，檢出限為8μg/mL(S/N=5)；熒光法測定Vtg的線性范圍為1.9—30μg/mL，檢出限為1μg/mL(S/N=5)。分別對魚血清樣品進(jìn)行5次平行測定，紫外分光法與內(nèi)源熒光法檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.4％(n=5)及3.4％(n=5)。該方法操作簡單、快速、重現(xiàn)性好。將本方法應(yīng)用于美國紅魚(Sciaenops ocellatus)血清中Vtg的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

6、美國紅魚血清中Vtg的離子交換色譜行為與真鯛魚血清Vtg的相似，說明本方法通用性較強。 3．Vtg作為環(huán)境雌激素生物標(biāo)志物的研究 以Vtg作為生物標(biāo)志物，研究了DES、EE2及兩者的混合物對美國紅魚幼魚的濃度一效應(yīng)及時間一效應(yīng)關(guān)系，并以Vtg為主要指標(biāo)考察了DES和EE2對美國紅魚的聯(lián)合雌激素效應(yīng)。結(jié)果如下： (1)DES和EE2對美國紅魚幼魚具有一定的毒性作用，可使個體異常，嚴(yán)重者死亡。 (2)DES、

7、EE2及兩者的混合物均使美國紅魚肥滿度降低、肝胰臟指數(shù)與腎臟指數(shù)增加。雌激素濃度增加及暴露時間延長，均使這種影響的結(jié)果加重。濃度梯度實驗中，DES、EE2及兩者的混合物對肝臟指數(shù)的影響最明顯，對肥滿度的影響最小；時間序列實驗中，雌激素對肥滿度的影響在第30 d顯著性出現(xiàn)，對腎臟指數(shù)的影響在第18 d顯著性出現(xiàn)，而對肝胰臟指數(shù)的影響則在第9 d就顯著性出現(xiàn)。 (3)DES、EE2及兩者的混合物在較低濃度(三者濃度分別小于320、1

8、60和120ng/L)時，隨濃度的增加美國紅魚血清總蛋白濃度及Vtg濃度增加。但隨著雌激素濃度的進(jìn)一步提高，血清總蛋白及Vtg的濃度逐漸降低，出現(xiàn)典型的Hormesis現(xiàn)象。隨著暴露時間的增加，血清總蛋白及Vtg的濃度逐漸增加，體現(xiàn)了很好的時間一效應(yīng)關(guān)系。與各項生理指標(biāo)及血清總蛋白濃度相比，Vtg濃度的變化最顯著、最迅速，最能體現(xiàn)DES和EE2的雌激素效應(yīng)，說明Vtg是一種較好的環(huán)境雌激素生物標(biāo)志物。 (4)在Vtg濃度與各指標(biāo)

9、之間的關(guān)系中，Vtg與肥滿度沒有相關(guān)性，而Vtg濃度與血清總蛋白有很好的正相關(guān)性(P＜0.001)。Vtg濃度與肝胰臟指數(shù)和腎臟指數(shù)的相關(guān)性有一定的相似性：即Vtg濃度與二者之間有一定的相關(guān)性(P＜0.05)；當(dāng)Vtg濃度較低時，這種相關(guān)性更加明顯(P值小于或接近0.01)；而當(dāng)Vtg濃度高時，與兩者的相關(guān)性降低(P＞0.05)。 (5)DES和EE2對美國紅魚幼魚的劑量—效應(yīng)關(guān)系符合典型的S形劑量—效應(yīng)關(guān)系，用Logistic