魚類卵黃蛋白原調(diào)理作用的研究.pdf

1、硬骨魚類雖然具有和高等脊椎動物相似的免疫系統(tǒng),但作為低等脊椎動物,其特異性免疫機(jī)制尚不完善,非特異性免疫占據(jù)更為重要的地位。在非特異性免疫中,吞噬細(xì)胞在魚類抗感染免疫中發(fā)揮核心作用。一些能與抗原結(jié)合并促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬功能的物質(zhì)稱為調(diào)理素;通過結(jié)合調(diào)理素輔助吞噬作用的現(xiàn)象稱為調(diào)理化。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的調(diào)理素主要有補(bǔ)體活化成分C3b及IgG類抗體。新近,Li等人(2008;2009)的研究表明魚類卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vg)也

2、能發(fā)揮調(diào)理素的功能。然而,關(guān)于Vg參與調(diào)理作用的機(jī)理完全不了解。本論文主要目的就是研究Vg的調(diào)理作用類型與機(jī)理。
　　 本論文首先利用Percoll密度梯度離心法從鱸魚(Lateolabrax japonicus)頭腎中分離純化得到了巨噬細(xì)胞,并對其噬菌功能進(jìn)行了鑒定。通過吞噬實驗統(tǒng)計兩個參數(shù)--吞噬能力(PA)和吞噬指數(shù)(PI)來評價巨噬細(xì)胞的噬菌水平,發(fā)現(xiàn)鱸魚頭腎巨噬細(xì)胞和酵母作用90min時吞噬能力可能達(dá)到最大值。然后,用

3、鱸魚頭腎巨噬細(xì)胞吞噬與六線魚(Hexagrammos otakii)Vg孵育過的酵母,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比,經(jīng)Vg處理的實驗組的PA和PI都有顯著性提高(P＜0.05),說明Vg的調(diào)理素功能不具有種屬特異性。利用六線魚Vg可以促進(jìn)鱸魚頭腎巨噬細(xì)胞吞噬作用這一系統(tǒng),接著我們證明了Vg調(diào)理功能可被lavendustin(蛋白酪氨酸激酶PTK的特異性抑制劑)、PP1(蛋白酪氨酸激酶PTK的特異性抑制劑)和staurosporine(蛋白激酶C

4、 PKC抑制劑)所影響;但不受nocodazole(微管抑制劑)和C3 exoenzyme(Rho GTPases抑制劑)的影響,說明Vg的調(diào)理功能可能屬于Ⅰ型機(jī)制。由于巨噬細(xì)胞Ⅰ型調(diào)理是由巨噬細(xì)胞膜表面受體FcγRs介導(dǎo),激發(fā)吞噬信號傳導(dǎo)通路。接下來,我們進(jìn)一步驗證FcγRs是否參與了Vg的調(diào)理。我們用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的FcγRs三類受體的單克隆抗體FcγRⅠ、FcRⅡ和FcγRⅢ與鱸魚巨噬細(xì)胞孵育,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這

5、三種單克隆抗體均可以與巨噬細(xì)胞結(jié)合,表明巨噬細(xì)胞表面存在FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ這三種受體。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)而用這三種單抗對巨噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體進(jìn)行封閉,檢測受體封閉對Vg的調(diào)理功能的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比,受體封閉能不同程度地抑制巨噬細(xì)胞吞噬vg孵育過的酵母,說明Vg可能通過與FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ這三種受體結(jié)合介導(dǎo)調(diào)理過程。我們還對蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶是否參與Vg調(diào)理過程進(jìn)行了研究。用蛋白

6、質(zhì)酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶各自的特異性抑制劑piceatannol和wortmannin對鱸魚巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理,通過realtime PCR的方法檢測Vg調(diào)理后炎癥因子TNF-α和IL-1β基因表達(dá)量的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照相比,抑制劑處理組的TNF-α和IL-1β表達(dá)量有顯著性下降(P＜0.05),說明蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶可能參與Vg調(diào)理過程的信號傳導(dǎo),影響炎癥因子的產(chǎn)生。
　　 總之,本文首次證明了