高山被孢霉延長酶基因的反轉(zhuǎn)錄及其同源表達(dá)的研究.pdf

1、花生四烯酸(ARA)是人體一種必需的多不飽和脂肪酸,它不僅在營養(yǎng)代謝中起重要作用,而且還被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等各種領(lǐng)域,有著廣闊的應(yīng)用前景。但是傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝并不能滿足日益增加的市場需求,需要從分子水平進(jìn)行改造以提高ARA的發(fā)酵生產(chǎn)水平。
　　 本文首先以高山被孢霉的總RNA為模板,通過PCR反轉(zhuǎn)錄技術(shù)擴(kuò)增出高山被孢霉延長酶基因(GLELO),將其克隆到simple T Vector,構(gòu)建重組質(zhì)粒T-GLELO。由于GL

2、ELO序列上有含有BamH I酶切位點(diǎn),與要插入pD4質(zhì)粒所用酶切位點(diǎn)一致,需敲除GLELO因上的BamH I酶切位點(diǎn),實(shí)驗(yàn)在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下,選取370,371和372這3個(gè)堿基(GGG)所編碼的Gly進(jìn)行定點(diǎn)突變將其突變成GGT(Gly)。酶切鑒定和測序結(jié)果均表明定點(diǎn)突變成功,得到重組質(zhì)粒T-GLELO*。
　　 其次,為了使高山被孢霉的延長酶基因?qū)崿F(xiàn)同源表達(dá),必須在GLELO*上下游加入高山被孢霉能識別的啟動

3、子his H4.1p和終止子trpCt。實(shí)驗(yàn)以pD4質(zhì)粒為模板,通過PCR擴(kuò)增出his H4.1-hpt-trpCt片段,并克隆到simple T Vector,得到重組質(zhì)粒T-his H4.1-hpt-trpCt。再將重組質(zhì)粒T-his H4.1-hpt-trpCt上的潮霉素基因(hpt)替換成經(jīng)過定點(diǎn)突變的延長酶基因(GLELO*),獲得重組質(zhì)粒T-his H4.1-GLELO*-trpCt。最后將his H4.1-GLELO*-t

4、rpCt片段再插入到pD4質(zhì)粒中,獲得重組質(zhì)粒pD4-GLELO*。
　　 此外,實(shí)驗(yàn)對高山被孢霉原生質(zhì)體的形成因素和重組pD4-GLELO*的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,采用總酶濃度為8 mg/mL,蝸牛酶和纖維素酶1∶1的比例的酶解液在25℃下酶解菌齡為3 d的菌絲3 h后,回收原生質(zhì)體溶解于以1 mol/L的山梨醇為穩(wěn)定劑的磷酸鹽緩沖液中,可獲得最大的原生質(zhì)體產(chǎn)量4.16×107個(gè)/mg;采用線性化的重組質(zhì)粒和聚乙二醇P

5、EG4000來介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率最高為1.8個(gè)/μg。
　　 最后,實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)化成功的高山被孢霉重組菌株進(jìn)行了初步的搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)。搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組菌株與野生型菌株在生物量和總油脂產(chǎn)量方面沒有較大區(qū)別,但是ARA的產(chǎn)量由3.2 g/L提高到了4.2 g/L,且ARA占總油脂的比例提高了近10％。發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高山被孢霉重組菌株的生物量可達(dá)48 g/L,油脂和ARA的產(chǎn)量分別為17.3 g/L和7.9 g/L