GSP對乙醇損傷后大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響及氧自由基的研究.pdf

1、背景與目的：
　　現(xiàn)如今，人們時常“以酒慶功、以酒交友、以酒助興”。酒其主要成分是乙醇，是一種親神經(jīng)的小分子物質(zhì)，能迅速通過血腦屏障，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷。海馬神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)和功能最復(fù)雜，最特殊的細(xì)胞之一，對乙醇毒性作用敏感性較高，長時間的乙醇暴露，可引起海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而導(dǎo)致認(rèn)知能力和記憶能力的降低。本研究主要通過構(gòu)建不同濃度乙醇及葡萄籽原花青素（GSP）作用下的原代大鼠海馬細(xì)胞模型，采用激光共聚

2、焦顯微鏡觀察不同時間點的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，酶標(biāo)儀測定SOD活性、MDA及LDH的含量變化，為進(jìn)一步探究乙醇對神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制和如何減輕乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、從清潔級（SPF級）的SD大鼠乳鼠（出生24h內(nèi)）分離海馬細(xì)胞，培養(yǎng)至第7天，采用SP法進(jìn)行NSE免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞純度，選擇生長良好，純度較高的海馬細(xì)胞隨機分成低劑量、中劑量、高劑量組，在培養(yǎng)液中加入無水乙醇，使其終濃度為0.5g

3、/L、1.5g/L、3.0g/L。對照組則加入等量的PBS溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別作用1h、4h、8h、12h、24h；收集細(xì)胞上清液備用，培養(yǎng)液洗3遍后換液后加入低、中、高劑量的葡萄籽原花青素，使其終濃度為1mg/L、2.5mg/L、5mg/L，對照組加入等量的PBS溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別作用8h、24h。收集細(xì)胞上清液備用。
　　2、采用超氧化物歧化酶測定試劑盒（WST-1法）、微量丙二醛測定試劑盒（TBA法）和乳酸脫氫酶測定試

4、劑盒（微量酶標(biāo)法）分別測定不同時間點不同濃度乙醇和葡萄籽原花青素作用下的細(xì)胞上清液中SOD活力、MDA和LDH含量。
　　3、通過激光共聚焦顯微鏡觀察不同時間點、不同濃度乙醇和葡萄籽原花青素作用下海馬神經(jīng)元形態(tài)的變化。
　　4、統(tǒng)計分析方法：所得數(shù)據(jù)均用據(jù)進(jìn)行多因素方差分析，LSD法進(jìn)行兩兩比較，檢驗水平α=0.05。s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度不同時間的乙醇和GSP作用

5、下的海馬細(xì)胞上清液中SOD活力、MDA、LDH含量與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），低劑量乙醇作用后，SOD、MDA、LDH含量變化不明顯，中高劑量乙醇作用后，各時間點SOD活力值明顯下降， MDA和LDH釋放量則明顯升高。作用1h、4h后，SOD活力值不斷減少，MDA和LDH含量不斷升高，高劑量乙醇作用8h后SOD活性僅為10.67±0.393 U/ml，為最低值；與中劑量相比，8h時間點處的高劑量 GSP組的SOD活力

6、升高了1.09±0.987 U/ml。MDA含量浮動最大，降低了0.192±0.002 nmol/mL，與8h、24h高劑量乙醇組相比，低GSP組的SOD活力有所升高，MDA含量略降低，與低劑量組相比，8h高劑量GSP組LDH含量變化最為明顯，與中劑量乙醇組相比，GSP組的 LDH含量差異較為顯著。與高劑量乙醇組相比，高GSP組LDH含量變化最大，降低了189.78±1.68 U/L。
　　2、不同時間不同濃度乙醇作用下的原代海馬

7、神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)過免疫熒光染色后，對照組細(xì)胞胞體形態(tài)多呈梭形、三角形或橢圓形，核居中，胞體飽滿且邊界清晰，發(fā)出一個或多個較粗的絲狀突起，相互連接形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，染色較為均勻，0.5g/L乙醇作用不同時間的海馬細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。1.5g/L乙醇作用4h，胞間絲開始減少，作用8h后，受損的細(xì)胞開始分泌神經(jīng)元粘附分子（NCAM），促使部分細(xì)胞開始聚團(tuán)，隨著作用時間加長，細(xì)胞密度明顯降低，有衛(wèi)星現(xiàn)象出現(xiàn)，胞間絲斷裂，部分消失；3.0g/L乙醇作用1h

8、后，細(xì)胞已開始聚團(tuán)，胞間絲斷裂，變短，隨著作用時間不斷增加，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增多，海馬細(xì)胞幾乎全部聚團(tuán)，核變小，藍(lán)染加深，細(xì)胞呈短棒狀，胞間幾乎不見連接，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已完全破壞，部分細(xì)胞已經(jīng)死亡。低中高劑量GSP作用后，可見部分胞體界限變得清晰，胞間絲明顯變粗，染色加深，連接變稠密，部分胞體接近正常，細(xì)胞連接恢復(fù)，聚團(tuán)成簇現(xiàn)象明顯減少，可見稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)論：
　　1、乙醇作用海馬細(xì)胞后，上清液中SOD活力值明顯降低，

9、MDA和LDH含量明顯升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢，與作用時間相關(guān)。說明乙醇增強了海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)，產(chǎn)生毒性作用。GSP可明顯提高乙醇損傷后海馬細(xì)胞上清液中SOD活力值，降低MDA和LDH的釋放與生成，且呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢，提示GSP有抗氧化和保護(hù)海馬細(xì)胞的作用。
　　2、乙醇可使海馬細(xì)胞密度降低，胞體損傷，邊界模糊，胞間絲變細(xì)變短，甚至斷裂消失，數(shù)量減少，破壞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。GSP對海馬細(xì)胞形態(tài)有保護(hù)作用，修復(fù)受損的海馬細(xì)胞，高