選擇性CFTR氯離子通道天然小分子抑制劑發(fā)現(xiàn)及其在上皮液體分泌研究中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，CFTR)是一種在上皮細胞頂膜中表達的氯離子通道，在調(diào)節(jié)離子和水分的跨膜運輸，尤其是分泌型腹瀉的治療方面具有至關(guān)重要的作用。本研究的目的是自中國傳統(tǒng)中藥中篩選具有CFTR氯離子通道抑制作用的天然活性小分子化合物，以及通過藥理學研究解釋傳統(tǒng)中藥的抗瀉機制，以期為抗瀉藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和事實

2、依據(jù)。
　　方法：
　　1.CFTR氯離子通道功能測定模型:本研究利用成熟的CFTR功能測定細胞模型（熒光淬滅模型）進行抑制劑的初步篩選和CFTR氯離子通道的活性分析。該模型是2001年由Galietta等人設(shè)計的，用于CFTR抑制劑和激活劑的高通量篩選。我們利用小鼠/人CFTR和熒光綠蛋白突變體EYFP(YFP-H148Q)表達質(zhì)粒穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染Fischer大鼠甲狀腺上皮細胞(FRT)，建立氯離子通道功能測定模型。
　

3、　2.CFTR抑制劑的高通量篩選和活性引導(dǎo)下的化合物分離解析:利用熒光淬滅模型對實驗室先前建立的中藥樣品組分庫的40，000種組分實施高通量篩選。對于獲得的活性組分，在活性引導(dǎo)下通過有機溶劑抽提、萃取、柱層析和制備型高效液相色譜(Prep-HPLC)等方法分離得到活性單體化合物，并通過分析型高效液相色譜(Anal-HPLC)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)等技術(shù)對活性化合物的結(jié)構(gòu)進行解析。
　　3.細胞水平上的藥理學活性的分析方

4、法:利用熒光淬滅模型對獲得的CFTR抑制劑進行必要的藥理學活性分析，其中包括量-效關(guān)系、時間動力學、可逆性等。
　　4.離體組織水平上的藥理學活性分析:利用尤斯灌流室(Using chamber)電壓鉗系統(tǒng)研究活性化合物對小鼠回腸粘膜以及大鼠結(jié)腸粘膜CFTR介導(dǎo)的短路電流的影響。
　　5.活體水平上的藥理學活性研究:利用小鼠腸道閉環(huán)(Closed-loop)實驗測定中藥活性組分對霍亂毒素誘導(dǎo)的小鼠腸道液體分泌的抑制作用。

5、r>　　結(jié)果：
　　1.利用CFTR氯離子通道功能測定細胞模型，從提取自五百種中草藥的40，000種中藥組分中分離到3種中藥的活性組分，其中包括冬凌草提取物的連續(xù)的8個活性組分、檳榔提取物的連續(xù)的7個活性組分以及公丁香提取物的連續(xù)的8個活性組分。
　　2.在活性引導(dǎo)下，采取多種分離提取技術(shù)對冬凌草、檳榔和公丁香中的活性成分進行分離。從冬凌草中分離獲得的小分子單體化合物、公丁香的乙酸乙酯提取物和檳榔的水提物中檢測到CFTR氯離

6、子通道抑制活性，并通過分析型高效液相色譜對活性化合物進行監(jiān)測。
　　3.通過分析型高效液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)對從冬凌草中提取的活性小分子單體化合物進行結(jié)構(gòu)解析，經(jīng)對比鑒定該活性化合物為冬凌草甲素。
　　4.細胞水平實驗對冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物的CFTR氯離子通道抑制活性進行分析，結(jié)果顯示上述化合物/組分均能以劑量依賴的方式抑制CFTR氯離子通道活性，IC50值分別為46.8μM、42.5 mg/L

7、和52mg/L;冬凌草甲素和公丁香乙酸乙酯提取物對CFTR氯離子通道的抑制作用具有可逆性;公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物能夠顯著抑制多種激活劑對CFTR氯離子通道的激活作用。
　　5.離體組織水平實驗結(jié)果顯示，冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物對跨大鼠結(jié)腸粘膜和小鼠回腸的CFTR氯離子通道介導(dǎo)的短路電流具有顯著的抑制作用。上述化合物/活性組分對跨大鼠結(jié)腸粘膜的Cl-轉(zhuǎn)運的抑制活性的IC50值分別為:62μM、59.7

8、mg/L和93 mg/L;小鼠回腸的實驗結(jié)果顯示，三種活性化合物/活性組分濃度分別為50μM、50 mg/L和50 mg/L時，即可對CFTR氯離子通道介導(dǎo)的短路電流起到四成左右顯著的抑制作用。
　　6.通過小鼠腸道閉環(huán)實驗對冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和檳榔水提物對小鼠腸道液體分泌速度的抑制作用進行分析，結(jié)果表明上述冬凌草甲素(3.644μg)、公丁香乙酸乙酯提取物(10μg)和檳榔水提物(10μg)都能在6小時的時間內(nèi)有效

9、抑制霍亂毒素介導(dǎo)的腸道液體分泌。
　　結(jié)論：
　　本研究通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)冬凌草中具有CFTR氯離子通道抑制活性的成分，在活性引導(dǎo)下分離提取的活性單體化合物——冬凌草甲素是CFTR氯離子通道天然的小分子抑制劑;首次闡述了傳統(tǒng)止瀉中藥——公丁香的抗瀉機制，是通過阻斷CFTR氯離子通道來抑制腹瀉引起的腸道電解質(zhì)紊亂和體液流失;發(fā)現(xiàn)檳榔對CFTR氯離子通道的抑制作用，以及中藥檳榔首次被發(fā)現(xiàn)具有抗瀉的新活性;本研究獲得的活性小分子化