酸敏感離子通道ASIC1a抑制劑的高通量篩選模型研究.pdf

1、缺血性腦中風(fēng)的機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為酸敏感離子通道（ASICs）在其中具有重要的作用，成為研究的熱點(diǎn)。酸敏感離子通道（ASICs）是一類由胞外酸化激活的陽離子通道，近期研究發(fā)現(xiàn)酸敏感通道ASIC1a介導(dǎo)的鈣超載在腦卒中引起的神經(jīng)元損傷機(jī)制中具有重要作用。那么發(fā)現(xiàn)特異性、高活性天然小分子ASIC1a的阻斷劑將成為治療腦卒中誘發(fā)神經(jīng)元損傷的新靶點(diǎn)。 ASIC1a少量表達(dá)在神經(jīng)元胞體、軸突、樹突棘膜上，大部分表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。首先構(gòu)建了

2、pcDNA3．1/Zeocin—mASIC1a—myc—His質(zhì)粒，檢測ASIC1a在COS-7、293—T、293—A、SMMC-7221、MMT、FRT、CHO七種細(xì)胞中的分布，獲得ASIC1a在各種細(xì)胞中表達(dá)的初步資料。發(fā)現(xiàn)FRT和CHO二種細(xì)胞是適于ASIC1a上膜并能用于高通量篩選的細(xì)胞系。據(jù)報(bào)導(dǎo)共表達(dá)P11和ASIC1a促使ASIC1a的上膜表達(dá)，構(gòu)建P11蛋白和ASIC1a共表達(dá)載體pBudCE4．1—mP11—mASIC

3、1a，以此構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)P11和ASIC1a的細(xì)胞系。利用逆轉(zhuǎn)錄半定量PCR、免疫熒光技術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后克隆ASIC1a的表達(dá)。 此外，摸索適合于高通量篩選的方法，為抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ)。本文應(yīng)用鈣敏感的熒光蛋白（cameleon-2載體）、鈣離子敏感熒光染料Fura-2/AM和細(xì)胞毒性（LDH釋放法）檢測法進(jìn)行ASIC1a功能檢測，目的是選出有功能性表達(dá)ASIC1a的細(xì)胞克隆，最終應(yīng)用于高通量篩選，使從中草藥小分子庫中篩選出高效