基于小鼠巨細(xì)胞病毒M84抗原優(yōu)勢(shì)表位的VLP疫苗的研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人群中感染普遍，能夠在免疫功能不全的病人中引起嚴(yán)重的疾病，特別是器官移植病人、艾滋病患者以及有先天性HCMV感染的新生兒。目前還沒(méi)有運(yùn)用于臨床的HCMV疫苗。雖然臨床上已經(jīng)有一些針對(duì)HCMV感染的治療性藥物，但存在毒性及耐藥性等問(wèn)題，因此研發(fā)出有效預(yù)防HCMV感染的疫苗尤為重要。病毒樣顆粒（virus-like particleVLP）疫苗是一種新型的亞單位疫苗。VL

2、P是不含病毒基因組，不具有病毒復(fù)制能力的多聚蛋白結(jié)構(gòu)。乙肝病毒核心抗原(hepatitis Bvirus core protein，HBcAg)作為蛋白載體可以提高目的抗原的免疫原性，在VLP疫苗研究中運(yùn)用廣泛。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，與HCMV UL83基因同源的小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV) M84基因在小鼠體內(nèi)能夠引起較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，有效抵抗致死量病毒感染。在本文中，將M84的一段含有一

3、個(gè)T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位的基因序列與HBcAg基因共表達(dá)制成VLP疫苗（簡(jiǎn)稱HBc-M84ep），以MCMV感染Balb/c小鼠為模型，探究HBc-M84ep蛋白抗致死量MCMV攻擊的保護(hù)效果。
　　本研究分為兩個(gè)部分。(一)HBc-M84ep亞單位疫苗的制備:選取HBcAg的1-149位氨基酸序列，將含有M84優(yōu)勢(shì)表位（297AYAGLFTPL305）的一段51個(gè)氨基酸序列插入并替換掉HBcAg的75-84位氨基酸，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

4、到大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)出的蛋白經(jīng)過(guò)裂解、超聲破碎、Ni-珠純化、超濾等一系列操作得到單一的目的蛋白，即HBc-M84ep蛋白，經(jīng)western blotting鑒定得到確認(rèn)。（二）HBc-M84ep亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果:選取6-8周齡的小鼠隨機(jī)分組，分別用1μg、6μg、30μg劑量的HBc-M84ep蛋白單獨(dú)或輔以MF59佐劑進(jìn)行腹腔免疫，免疫兩次，間隔三周。未免疫組小鼠作為對(duì)照。第二次免疫三周后用致死量MCMV攻擊小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

5、，劑量為1μg的HBc-M84ep蛋白單獨(dú)免疫小鼠不能為小鼠提供抗致死量MCMV的感染，與對(duì)照組小鼠一樣，在攻毒后的7天內(nèi)全部死亡;6μg和30μg HBc-M84ep蛋白單獨(dú)免疫小鼠能為小鼠提供部分保護(hù)，存活率僅為10％和40％。在該蛋白疫苗中添加MF59佐劑后，1μg、6μg和30μg蛋白劑量均能為小鼠提供較好的保護(hù)，其中免疫1μg劑量的小鼠其存活率達(dá)90％，免疫6μg或30μg劑量的小鼠存活率都達(dá)到100％。此外，完全保護(hù)組或保護(hù)