小劑量超短波聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對大鼠脊髓損傷后巨噬細(xì)胞亞型分化的影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察小劑量超短波(ultrashort wave，USW)聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow stromal cells，BMSCs)移植治療對大鼠脊髓損傷后巨噬細(xì)胞亞型分化的影響以及超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticle，SPIO）對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的長期示蹤標(biāo)記效果。
　　方法:取4周齡GFP+大鼠分離培養(yǎng)BMSCs，用濃度為25μg/ml Fe

2、的SPIO標(biāo)記第3代BMSCs，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測SPIO標(biāo)記對干細(xì)胞增殖影響，普魯士藍(lán)染色測定標(biāo)記效果，激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡觀察SPIO在干細(xì)胞內(nèi)的分布。雌性SD大鼠16只，隨機(jī)分為2組:BMSCs移植組（BMSCs組，n=8）手術(shù)后于T10損傷區(qū)域立即注入密度為1×106/μl SPIO標(biāo)記的BMSCs5μl;聯(lián)合治療組(USW+BMSCs組，n=8)手術(shù)后于T10損傷區(qū)域立即注入密度為1×106/μl的SPIO標(biāo)記的BM

3、SCs5μl，于SCI術(shù)后24h后給以小劑量的USW治療（最大輸出功率40 W，實(shí)際輸出功率11.58 W）治療，7 min/次，1次/d，至取材前;4w后取材分別行石蠟切片在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP+BMSCs，并做普魯士藍(lán)染色;制作透射電鏡標(biāo)本并觀察。102只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組（sham組）、對照組（control組）、USW治療組（USW組）、BMSCs移植組（BMSCs組）、聯(lián)合治療組（U

4、SW+BMSCs組）。sham組(n=6)在暴露硬脊膜后，不予任何處理直接縫合;control組(n=24)采用Allen打擊法建立脊髓損傷模型，不給予任何治療;USW組(n=24)在SCI后第2天開始給予受損部位小劑量超短波治療;BMSCs組(n=24)在SCI后立即于受損部位立即注入密度為1×106/μl BMSCs5μ l;USW+BMSCs組(n=24)在SCI后立即于受損部位立即注入密度為1×106/μl BMSCs5μ l，

5、并于SCI后第2天行小劑量超短波治療，至取材前。于造模后1d、3d、7d行BBB評分評定大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，免疫組織化學(xué)染色檢測巨噬細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)抗原(ED-1)、一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)的表達(dá)，觀察USW聯(lián)合BMSCs移植治療對大鼠SCI后巨噬細(xì)胞極化方向的影響，并初步探討其對脊髓損傷后減輕炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，①BBB評分結(jié)果顯示，SCI術(shù)后1-3d，同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)B

6、BB評分均有所增高，但組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性（P＞0.05），在術(shù)后7d，USW組、USW+BMSCs與control組相比，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）;②ED-1陽性細(xì)胞數(shù)量在SCI術(shù)后7d至高峰，USW組、BMSCs組、USW+BMSCs組ED-1表達(dá)量在術(shù)后3d時(shí)較control組少(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7d，USW組、BMSCs組、USW+BMSCs組ED-

7、1陽性蛋白表達(dá)量少于control組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001)。USW+BMSCs組的ED-1表達(dá)在術(shù)后7d較BMSCs組相比有明顯下降(P＜0.05)。③iNOS陽性IOD值測定:SCI術(shù)后1-7diNOS陽性細(xì)胞表達(dá):術(shù)后3d，USW組、BMSCs組和USW+BMSCs組與control組相比iNOS的表達(dá)減少（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001）;BMSCs組、USW+BMSCs組

8、與USW組相比iNOS的表達(dá)減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05).術(shù)后7d，USW組、BMSCs組和USW+BMSCs組與control組相比iNOS表達(dá)減少（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）;④Arg-1蛋白陽性表達(dá)較sham組均增多，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組都是在第3d達(dá)到高峰。第7d BMSCs組和USW+BMSCs組Arg-1表達(dá)量高于control組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01）。⑤SPIO標(biāo)

9、記第3代GFP+BMSCs在激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有綠色熒光和SPIO陽性顆粒，干細(xì)胞呈長梭形。高倍鏡下可見SPIO顆粒主要聚集在細(xì)胞核膜周圍，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有分布，標(biāo)記率達(dá)98％以上，和普魯士藍(lán)染色結(jié)果相一致。細(xì)胞質(zhì)中的膜性細(xì)胞器如溶酶體和線粒體中均出現(xiàn)團(tuán)塊狀或點(diǎn)狀分布的SPIO顆粒。但細(xì)胞核內(nèi)并沒有SPIO。在SCI術(shù)后4w后取材透射電鏡和激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有BMSCs存活，且細(xì)胞呈多形性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見明顯