小劑量超短波對種植BMSCs脫細(xì)胞支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的作用.pdf

1、目的: 超短波治療具有消除炎癥、減少水腫、促進(jìn)血管舒張、改善血液循環(huán)、營養(yǎng)組織器官和增強(qiáng)組織代謝的功效，超短波對損傷組織的修復(fù)作用在康復(fù)學(xué)領(lǐng)域已得到證明并已被廣泛應(yīng)用。有研究證明，通過脫細(xì)胞支架和超短波治療結(jié)合的方法，在修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的治療中起到了加速神經(jīng)生長速度的作用。近年來隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，應(yīng)用帶有種子細(xì)胞的支架材料修復(fù)周圍神經(jīng)損傷已經(jīng)日趨成熟。同種異體脫細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)材料(acellular extrac

2、ellular matrix，AECM)作為有生物活性的神經(jīng)替代物，具有良好的仿生性和組織相容性，移植后為軸突再生提供適宜的微環(huán)境，能夠有效促進(jìn)神經(jīng)再生。近年來隨著對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)分化為施萬細(xì)胞研究的日益深入，證明它具有可塑性高、免疫原性低、體外易于獲得能夠快速擴(kuò)增和長期存活的特性，這些條件使之成為修復(fù)周圍神經(jīng)損傷理想的種子細(xì)胞。本實驗是觀察小劑量超短波對種植BMSC的

3、脫細(xì)胞支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的作用，為臨床神經(jīng)損傷修復(fù)和康復(fù)治療提供實驗依據(jù)。 材料與方法: 1、脫細(xì)胞神經(jīng)移植物的制備 Wistar大鼠，經(jīng)麻醉后取出兩側(cè)的坐骨神經(jīng)，采用化學(xué)萃取脫細(xì)胞方法制備脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)支架。 2、BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取生后25～30天的雄性Wistar大鼠，從脛骨和股骨內(nèi)分離出BMSCs，采用貼壁法純化細(xì)胞并培養(yǎng)至第三代備用。 取第三代BMSCs分別在

4、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液和成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其形態(tài)的改變。茜草素紅染色和油紅O染色分別鑒定BMSCs向成骨和成脂肪誘導(dǎo)的細(xì)胞。 3、實驗動物和分組 雄性Wistar大鼠48只，體重為200～250g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，實驗分為3組，即支架內(nèi)注射達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、支架內(nèi)注射BMSCs組和注射BMSCs后應(yīng)用超短波治療組

5、，各組分別于移植后的第2、4、8和12周各處死4只。 4、脫細(xì)胞神經(jīng)支架移植 取第三代BMSCs，用微量注射器按照接種濃度為1×106個/毫升注入到制備好的支架內(nèi)并置于培養(yǎng)箱內(nèi)聯(lián)合培養(yǎng)3天；在無菌條件下縫合聯(lián)合培養(yǎng)的神經(jīng)支架到神經(jīng)缺損處。 5、超短波治療 術(shù)后第二天即采用小劑量超短波對移植動物的神經(jīng)缺損處治療。 6、觀察指標(biāo)及檢測方法 (1)光鏡和電鏡觀察AECM的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 (2

6、)在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的細(xì)胞生長情況。 (3)足跡實驗檢測大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic function index，SFI)，跟蹤觀察其神經(jīng)功能恢復(fù)情況。 (4)甲苯胺藍(lán)染色觀察再生神經(jīng)的纖維數(shù)目、軸突直徑，透射電鏡檢測再生神經(jīng)的髓鞘厚度。 (5)免疫熒光染色分析再生的神經(jīng)內(nèi)的S—100、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)和血管內(nèi)皮生長因

7、子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)。 (6) RT-PCR檢測再生的神經(jīng)內(nèi)S—100mRNA和VEGFmRNA表達(dá)。 7、統(tǒng)計學(xué)分析。 實驗結(jié)果: 1、光、電鏡觀察到采用化學(xué)萃取脫細(xì)胞方法制備的AECM完整地保留了以基底膜管為主構(gòu)成的三維立體結(jié)構(gòu)。 2、倒置顯微鏡下觀察到貼壁的BMSC細(xì)胞呈圓形，成纖維細(xì)胞樣或紡錘體樣，12天后能夠達(dá)到90％

8、融合。 3、用茜草素紅和油紅O分別對向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)各自向誘導(dǎo)的細(xì)胞分化，即有紅色的骨基質(zhì)的沉積和脂滴形成。 4、實驗動物行走實驗證明隨著時間的增長SFI逐漸上升，超短波治療組SFI上升的更快。 5、再生神經(jīng)的甲苯胺藍(lán)染色和透射電鏡檢測顯示：隨著移植術(shù)后時間增長，超短波治療組治療組的再生神經(jīng)髓鞘的厚度增加、直徑增大和神經(jīng)纖維數(shù)目增多。 6、免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)S—100蛋白和G

9、FAP蛋白在再生的神經(jīng)內(nèi)都有陽性表達(dá)并且和時間成依賴性增長，在超短波治療組的表達(dá)優(yōu)于其它兩組。VEGF的表達(dá)在第4周達(dá)到頂峰然后逐漸下降。 7、RT-PCR檢測再生的神經(jīng)內(nèi)S—100mRNA表達(dá)與時間增長成正比，超短波治療組內(nèi)的S—100mRNA和VEGFmRNA表達(dá)明顯增多。VEGFmRNA在術(shù)后第4周表達(dá)最多。 結(jié)論: 1、注入BMSCs的脫細(xì)胞支架對神經(jīng)損傷恢復(fù)的作用要好于單純的脫細(xì)胞支架，應(yīng)用超短波治療之