吳茱萸堿對嘌呤P2X4受體介導的慢性高葡萄糖引起血管內皮細胞炎性損傷的作用及機理研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　血管內皮細胞（HUVECs）在維持心血管系統(tǒng)的功能穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，血管內皮細胞功能異常化是導致糖尿病血管并發(fā)癥的啟動因素。研究表明高糖能誘導血管內皮細胞發(fā)生氧化應激反應，產生大量活性氧，導致一系列的炎癥反應，進而導致血管內皮細胞凋亡并引發(fā)動脈粥樣硬化。因此，保護血管內皮細胞對防止血管并發(fā)癥的發(fā)生具有重要作用。吳茱萸堿是從吳茱萸成熟果實中分離出來的生物堿化合物，具有抗炎癥作用，但抗炎機制尚不明確。P2 X

2、4受體是ATP受體的一個亞型，其過表達伴隨著細胞內Ca2+濃度的升高，在疼痛、炎癥反應和免疫反應中具有重要作用，但對P2X4受體是否在高糖誘導的HUVECs發(fā)生炎癥反應中起重要作用鮮有報道。本實驗旨在研究吳茱萸堿對慢性高葡萄糖引起HUVECs產生炎癥反應的保護作用及靶點，為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的依據(jù)。通過高葡萄糖刺激血管內皮細胞5天后，檢測P2X4受體、細胞核轉錄因子κB（NF-κB）、ROS、鈣離子（Ca2+）及一些炎癥因子的

3、變化，探索吳茱萸堿對慢性高葡萄糖引起HUVEC s產生炎癥反應的保護作用及機制。
　　方法：
　　(1)吳茱萸堿對細胞增殖的影響以濃度為0、0.1、0.25、0.5、1、4、8μM/L的吳茱萸堿分別處理血管內皮細胞24h、48h和72h，通過MTS測細胞增殖。
　　(2)細胞傳代后將細胞分為正常葡萄糖組（5.5Mm, CON）、高葡萄糖刺激組（44.4Mm,HG）、正常葡萄糖加吳茱萸堿組（CON+Evo）、高葡萄糖刺激

4、加吳茱萸堿組（HG+Evo）。高糖處理2天后加入?yún)擒镙菈A，共同處理3天，隔兩天換一次液。 MTS測細胞增殖。
　　(3)提取各組細胞、總RNA，通過Real Time PCR檢測P2X4受體mRNA表達變化。
　　(4)提取各組細胞總蛋白、核蛋白，通過蛋白印記檢測P2X4受體、腫瘤壞死因子（TNF-ɑ）、NF-κB的蛋白表達變化。
　　(5)熒光法檢測細胞內ROS和Ca2+的變化，應用硝酸還原酶法檢測細胞上清液一氧化氮

5、（NO）的變化。
　　結果：
　　(1)吳茱萸堿對HUVECs增殖的抑制是時間和劑量依賴性的，4μM吳茱萸堿處理24h顯著抑制HUVECs的增殖（p<0.05），0.25μM的吳茱萸堿處理細胞3天不會對細胞增殖產生影響。
　　(2)高糖顯著抑制HUVECs的增殖（p<0.01），0.25μM的吳茱萸堿能逆轉這種抑制。
　　(3)與 CON組相比，HG組 P2X4受體在 mRNA及蛋白水平表達量均升高（p<0.05

6、），而HG+Evo組，與HG組相比，P2X4受體表達量降低（p<0.05）。
　　(4)同時，HG組，TNF-ɑ和NF-κB表達上調（p<0.05），與HG組相比， HG+Evo組表達下降（p<0.05）。
　　(5)與CON組相比，HG組細胞內ROS和Ca2+濃度升高（p<0.05），細胞上清液NO含量顯著下降（p<0.01），而與HG組相比，HG+Evo組細胞內ROS和Ca2+濃度均下降（p<0.05），細胞上清液NO含