逐步pH靶向性口服納米藥物載體的制備及體內(nèi)外表征.pdf

1、化療藥物已經(jīng)廣泛用于癌癥臨床治療，實驗表明它能有效地抑制癌細胞生長和誘導細胞凋亡，但其較差的溶解性和吸收率以及復雜的生理屏障會嚴重影響藥物對體內(nèi)腫瘤的治療效果。此外，臨床上藥物進入機體主要通過口服或者靜脈的方式，這兩種方式均存在對應的缺陷。因此需要利用藥物載體包載藥物后再送入機體，保證在特定條件下釋放藥物，以避免藥物所產(chǎn)生的系統(tǒng)毒性。研究人員針對口服給藥和靜脈給藥設計了一系列的藥物載體，例如胃腸道靶向吸收的口服藥物載體，納米藥物傳遞載體

2、(Nano-DDS)，它們能夠起到較好的效果。并且這兩種給藥方式都有相應的優(yōu)點，例如口服給藥方便簡單，生物安全性高;靜脈給藥能達到最高的絕對生物利用度（Absolute bioavailability,AB），藥物發(fā)揮作用更快。但僅針對口服或靜脈給藥單方面進行改良的藥物載體，都有一些無法避免的缺點:口服給藥會造成極強的首過效應，最終導致更低的AB和更高的藥物毒性;靜脈注射的給藥方式會破壞皮膚且給藥后藥物濃度瞬間變化，可能引起較大的給藥風

3、險，對應的給藥生物安全性低。此外，由于口服給藥體系和靜脈注射體系存在明顯的pH梯度。因此可以通過設計一種具逐步pH靶向性的藥物載體來整合靜脈注射和口服給藥的優(yōu)點以盡可能改善二者的缺點。
　　本文擬制備一種具有雙層結構的口服納米藥物載體，外層為羧甲基殼聚糖(CMC)涂層，它能在胃部強酸環(huán)境中保護內(nèi)部載藥核心不被降解，最大程度上避免藥物傷害胃腸道;并且在腸道內(nèi)CMC涂層靶向小腸上皮細胞并打開緊密連接（Tight junctions，T

4、Js）來促進吸收。內(nèi)部為疏水核心包括聚（原酸酯-氨酯）P(OE-HMDI-CL)和化療藥物，它能保證該藥物載體被吸收進入血液后長時間穩(wěn)定循環(huán)，隨后通過實體瘤的高通透性和滯留(EPR)效應的被動靶向達到高效富集。最終癌細胞的微酸環(huán)境觸發(fā)原酸酯鍵斷裂，藥物載體崩解使得藥物在癌癥細胞內(nèi)快速富集，擬實現(xiàn)在高效地殺滅癌癥細胞的同時降低系統(tǒng)毒性。
　　本實驗通過在溫和條件下分步聚合的方式，將酸敏感性的二羥基原酸酯單體(OEOH)和高疏水性的聚

5、己內(nèi)酯(PCL)等比例地引入聚（原酸酯-氨酯）。核磁氫譜(NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)表征結果表明該聚合物被成功合成并且分子量(Mn=1.81×104)適中。接著通過常用的水包油超聲乳化法制備不同的納米微球:分別用聚乙烯醇(PVA)或CMC來制備單層納米微球（對照組）或雙層納米微球，對應命名為NP1和NP2。通過透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察到NP1和NP2的微觀形貌，成功證明NP2為雙層結構。動態(tài)光衍射(DLS)檢測表

6、明NP1和NP2的水合粒徑分別為196.3nm和359.8nm。通過傅立葉紅外光譜儀(FT-IR)和NMR表征，以及觀察NP1和NP2的離子緩沖能力，發(fā)現(xiàn)NP2為NP1和CMC的混合物，并且CMC位于NP2的外部。
　　然后通過模擬不同生理環(huán)境的體外和體內(nèi)實驗來驗證納米微球的穩(wěn)定性。首先，將NP1和NP2分別與體外強酸環(huán)境(pH=1.0)和胃部模擬液孵育一段時間后，發(fā)現(xiàn)了完全不同的狀況。NP1懸浮液由于原酸酯鍵快速斷裂，納米微球崩

7、解導致溶液很快就出現(xiàn)沉淀，而NP2懸浮液卻能穩(wěn)定存在，有極強的耐受強酸性。隨后，在體內(nèi)驗證NP2的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)高劑量的NP2通過口服的方式送入小鼠體內(nèi)后，能在小鼠血清中觀察到穩(wěn)定的納米微球結構，表明NP2能以藥物載體的形式穿過小腸間隙，并且無明顯的降解現(xiàn)象。
　　作為理想化的口服藥物載體，極好的生物相容性和生物安全性是必不可少的。MTT實驗表明NP1和NP2均不會對NIH/3T3細胞的生長造成任何抑制效果，各種不同濃度的納米微球與

8、細胞孵育后存活率均能到達95％以上。對小鼠口服不同劑量納米微球的急性毒性實驗發(fā)現(xiàn)即使在超高劑量的NP1或NP2(2000mg/kg)灌胃后，小鼠均正常增長。即使在攝入納米微球14天后，小鼠的血漿生化指標也均無異常且對小鼠主要器官也無顯著毒性。
　　本實驗旨在盡可能改善游離阿霉素(Free DOX)所產(chǎn)生的嚴重心臟毒性，因此將DOX制備成一種口服納米藥物載體，分別命名為NP1/DOX和NP2/DOX。通過計算發(fā)現(xiàn)，NP1/DOX和N

9、P2/DOX的載藥率(DLC)分別為14.32％和17.27％，表明NP1和NP2均能高效地負載藥物。在體外模擬體內(nèi)環(huán)境進行藥物釋放研究，結果表明載藥納米微球均能在低pH(5.0)條件下穩(wěn)定地進行藥物釋放;而在強酸條件(pH=1.0)下，僅有NP2/DOX能長時間保持藥物不被釋放。
　　相對較高的口服AB和合理的藥物分布是作為口服藥物載體的重中之重，本實驗就free DOX、NP1/DOX和NP2/DOX的口服AB進行研究，同時設

10、定靜脈注射劑量為6mg/kg free DOX的AB為100％。結果表明小鼠灌胃10mg/kg劑量的NP2/DOX后所達到的AB是75.4％，這分別是free DOX和NP1/DOX在相同劑量條件下口服AB的3.83和2.77倍，表明該雙層納米藥物載體能顯著提高DOX的口服AB。同樣對3種不同藥物配方給藥后的藥物分布情況進行測定，研究發(fā)現(xiàn)在口服free DOX和NP1/DOX后心臟內(nèi)DOX的富集量較高，其最大值均超過了4μg/g tis

11、sue，這將會帶來極大的風險，但相反腫瘤組織內(nèi)DOX的含量卻很低。而NP2/DOX組卻有不同的實驗現(xiàn)象，在口服該藥物劑型后心臟內(nèi)DOX的濃度一直都未超過1.6μg/g tissue;且腫瘤組織內(nèi)DOX的濃度相對于其他不同的劑型藥是最高的，最大值接近于8μg/g tissue。這是由于NP2/DOX可以以藥物載體的形式進入血液，然后通過EPR效應被動靶向腫瘤組織以達到高效富集。
　　最后，通過體內(nèi)實體瘤的抑制效果和治療過程中對器官的

12、損傷情況對該藥物載體的實際體內(nèi)性能進行評估。本實驗首先建立肝癌(H22)小鼠模型，然后采用劑量為10mg/kg的free DOX，NP1/DOX，NP2/DOX進行連續(xù)口服治療，此期間選取生理鹽水(Saline)，NP1和NP2作為陰性對照組。研究發(fā)現(xiàn)各個陰性對照組即使在連續(xù)灌胃7天后均無明顯區(qū)別，進一步驗證了納米微球具備優(yōu)異的生理相容性。雖然free DOX和NP1/DOX組相比于陰性對照組對腫瘤組織有一定的生長抑制效果，但并不是很明

13、顯;此外心臟和胃腸道切片顯示這些DOX劑型會產(chǎn)生極強的系統(tǒng)毒性。而NP2/DOX治療組出現(xiàn)了與其他治療組不同的治療效果，隨著治療天數(shù)的延長，腫瘤體積和重量均明顯減小。在經(jīng)過NP2/DOX連續(xù)治療7天后，腫瘤的重量僅僅為0.28g，這分別僅為saline，free DOX和NP1/DOX治療7天后腫瘤重量的14.99％，19.60％和19.95％，對應的腫瘤切片也顯示該組腫瘤組織內(nèi)細胞損傷區(qū)域面積最大并且程度最為明顯。最為重要的是經(jīng)過連續(xù)

14、7天的NP2/DOX治療后，小鼠的胃部和腸道切片顯示沒有明顯的損傷，進一步驗證了NP2在胃腸道中的超高穩(wěn)定性;同樣地，對應NP2/DOX治療后的心臟切片與對照組的形貌區(qū)別不大，表明該雙層納米藥物載體不會產(chǎn)生心臟毒性，具有超高的生物安全性。
　　綜上所述，該雙層結構的納米藥物載體(NP2/DOX)能通過口服的方式，達到非常高的生物利用度(75.4％)，連續(xù)給藥后無系統(tǒng)毒性并且能達到很好的抗癌效果。因此NP2/DOX在口服給藥領域具有