新型抗血小板劑氯吡格雷預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的研究.pdf

1、研究背景動(dòng)脈粥樣硬化疾病(Atherosclerosi，AS)是一種炎癥性疾病<'[1]>。雖然AS被認(rèn)為是血脂沉積動(dòng)脈壁造成的疾病，大量的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)闡明炎癥因素發(fā)揮了非常重要的作用。從細(xì)胞和分子機(jī)制的角度有助于清楚解釋，特別是AS的早期含有重要的炎癥成分<'[2]>。動(dòng)脈粥樣硬化是炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖、單核巨噬細(xì)胞吞噬大量的低密度脂蛋白膽固醇(low densitvlipoprotein cholestero

2、l，LDIL-C)成為泡沫細(xì)胞(foal cell)、細(xì)胞外基質(zhì)的增加和斑塊破裂血栓形成的慢性和急性炎癥等一種極為復(fù)雜的病理生理過程。AS早期的主要特征是白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等在損傷部位的粘附<'[3]>，早期AS病灶內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞的聚集，通過產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、化學(xué)因子促進(jìn)AS的形成和發(fā)展。在許多炎性因子中，P-選擇素(P-selectin)、血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(vascular cellular a

3、dhesion molecule-，VCAM-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemoattractant protein-1，MCP-1)是非常重要的調(diào)節(jié)血小板、白細(xì)胞、單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附和聚集，穿越血管內(nèi)膜進(jìn)入中層，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)無

4、限制的吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白膽固醇(oxidized LDL-C，ox-LDL-C)轉(zhuǎn)變成為泡沫細(xì)胞，促使AS斑塊的形成和發(fā)展。AS早期病變和炎癥反應(yīng)的關(guān)系可以概括為三個(gè)階段進(jìn)行描述<'[4、5)>。 第一階段：白細(xì)胞和血小板等粘附于損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞部位，主要和選擇素的參與有關(guān)，如選擇素．P、L、E等<'[6]>。血清中來源于血小板的可溶性選擇素-P與AS斑塊發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)<'[7]>，選擇素-P可以作為AS的檢測(cè)指標(biāo)。

5、第二階段：白細(xì)胞和血小板、單核細(xì)胞在血管細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞間粘附分子的幫助下從內(nèi)膜向中膜遷移，VCAM-1和ICAM-1介導(dǎo)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附<'[8]>，血清中ICAM-1的水平和AS的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)<'[9]>。第三階段：?jiǎn)魏司奘杉?xì)胞借助于單核趨化蛋白-1從內(nèi)膜到中膜遷移和增殖，變成巨噬細(xì)胞，吞噬大量的LDL-C，MCP-1是AS發(fā)生和進(jìn)展的重要組成要素<'[10、11]>。炎癥反應(yīng)在AS的形成和發(fā)展始終發(fā)揮至關(guān)重要的作用，

6、因此預(yù)防和控制AS應(yīng)該從傳統(tǒng)的單一降低血脂水平轉(zhuǎn)化為積極降低炎性因子的措施。他汀類藥物和傳統(tǒng)的血小板抑制劑阿司匹林雖然降低炎癥過程，由于生活方式的轉(zhuǎn)變和他汀類藥物特殊的代謝途徑，心血管死亡在美國(guó)、歐洲和亞洲如中國(guó)仍然是首位的死因<'[12、13]>。他汀類藥物的代謝途徑經(jīng)過CYP3A4B，與其他代謝酶在肝臟競(jìng)爭(zhēng)，造成轉(zhuǎn)氨酶升高，阿司匹林抵抗在AS病人高達(dá)25％，因此他汀類和阿司匹林都不能完全防止AS的發(fā)生和進(jìn)展，探索新的更加有效的防治A

7、S的藥物更加必要。本實(shí)驗(yàn)通過高脂喂養(yǎng)和動(dòng)脈內(nèi)膜損傷建立動(dòng)脈粥樣硬化模型<'[14]>，主要探討新型血小板抑制劑氯吡格雷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展的影響。AS的發(fā)展需要數(shù)年的過程，采取有效的防治措施阻斷該過程和防止有關(guān)并發(fā)癥。在非藥物措施中，平衡膳食和體力運(yùn)動(dòng)非常有效。藥物措施中主要包括膽固醇合成阻滯劑(他汀類調(diào)脂藥) 、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血小板聚集抑制劑(阿司匹林)。他汀類通過調(diào)脂之外的作用降低20～30％心血管死亡

8、、心梗和腦卒中，ACEI通過降壓之外的作用能夠降低心血管并發(fā)癥，與他汀類同樣有效，阿司匹林和氯吡格雷具有心血管不良事件的二級(jí)預(yù)防作用，國(guó)內(nèi)外關(guān)于阿司匹林的一級(jí)預(yù)防作用得到證實(shí)，對(duì)于氯吡格雷是否具有一級(jí)預(yù)防作用成為研究的熱點(diǎn)。 動(dòng)脈粥樣硬化引起的臨床事件與血小板活化密切相關(guān)，血小板活化參與動(dòng)脈粥樣斑塊的形成和發(fā)展<'[15]>。由于AS復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和病理生理特點(diǎn)，因此防治動(dòng)脈粥樣斑塊形成和發(fā)展目前極為棘手。近年研究證實(shí)阿司匹林具

9、有抑制動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)展的作用<'[16]>,新型抗血小板藥氯吡格雷防止冠脈支架術(shù)后血栓得到公認(rèn)<'[17]>，但是否具有防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成鮮有報(bào)道。他汀類調(diào)脂藥不僅可降低膽固醇，還能抑制血管平化細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡<'[18]>。他汀類調(diào)脂藥調(diào)脂之外作用，改善血管內(nèi)皮功能得到公認(rèn)<'[19]>。 本研究以兔高脂喂養(yǎng)聯(lián)合髂腹動(dòng)脈球囊損傷建立動(dòng)脈粥樣硬化<'[14>，通過觀察血小板抑制劑和他汀類調(diào)脂藥對(duì)炎性因子高敏C反應(yīng)蛋白(h

10、igh sensitivityC-reactive protein，hsCRP)、ICAM-1和VCAM-1、MCP-1的影響，旨在探討血小板抑制劑阿司匹林、氯吡格雷對(duì)防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的作用，是否可以和他汀類藥物相媲美。同時(shí)本研究觀察新型抗血小板藥氯吡格雷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖的影響，及血管球囊損傷后血管內(nèi)皮功能的作用和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，旨在探討抗血小板劑

11、預(yù)防兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的作用和機(jī)制。 目的 1．觀察抗血小板藥阿司匹林、氯吡格雷、阿托伐他汀對(duì)兔髂腹動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的影響； 2．觀察阿司匹林、氯吡格雷、阿托伐他汀對(duì)兔髂動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)皮功能及平滑肌細(xì)胞增殖的影響； 3．探討血小板抑制劑防治動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的作用和基本機(jī)制。 方法 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：2月齡健康純種新西蘭大耳白兔40只，雌雄兼有，體重1

12、.3～1.8kg，購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分6組。①正常組(n=6)，假手術(shù)+普通飼料；②模型組(n=7)，動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)+高脂飼料；⑧阿司匹林組(n=7)，動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)+高脂飼料邯可司匹林12.5mg/(kg·d)灌胃；④氯吡格雷組(n=7)，動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)+高脂飼料+氯吡格雷4mg/(kg·d)灌胃；⑤阿司匹林與氯吡格雷組(n=7)，動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)+高脂飼料+阿司匹林12.5mg/(kg·d)+氯吡格雷4mg/(kg

13、·d)灌胃；⑥阿托伐他汀組(n=6)，動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)+高脂飼料+阿托伐他汀3mg/(kg·d)灌胃。氯吡格雷由法國(guó)賽諾菲圣德拉堡杭州民生制藥有限公司提供(波立維，75 mg/Tab)，阿托伐他汀由輝瑞制藥有限公司提供(立普妥，10 mg/Tab)；高脂飼料(1％膽固醇、5％豬油、3％蛋黃粉、91％普通飼料)。 2．研究方法： 2．1模型建立 應(yīng)用高脂飲食聯(lián)合髂腹動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。除正常組外，其余5

14、組術(shù)后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)至8周末，阿司匹林、氯吡格雷組和阿托伐他汀組每日上午灌胃。 2．2生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)。免疫透射比濁法檢測(cè)hsCRP。ELISA法檢測(cè)ICAM-1/VCAM-1、MCP-1；用放射免疫法測(cè)定血清ET；用硝酸還原酶法測(cè)定血清NO。 2．3標(biāo)本采集與觀察8周末全部家兔處死，在腹主動(dòng)脈與髂動(dòng)脈分支以下0.5cm處取損傷側(cè)髂動(dòng)脈1cm，剝離外膜脂肪組織

15、，縱行剖開置于4％多聚甲醛、4℃固定后，逐級(jí)脫水、石蠟包埋、切片厚5 μ m。 2．3.1 病理形態(tài)學(xué)觀察 蘇木素-伊紅(HE)染色后攝像，光鏡切片分別測(cè)量動(dòng)脈內(nèi)膜厚度、中膜厚度，以微米(μm)表示，計(jì)算內(nèi)膜/中膜厚度比值。測(cè)定管腔面積、內(nèi)彈力板圍繞面積和外彈力板圍繞面積，新生內(nèi)膜面積(mm<'2>)=內(nèi)彈力板圍繞面積-管腔面積，中膜面積(mm<'2>)=外彈力板圍繞面積-內(nèi)彈力板圍繞面積，計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比值。 2

16、.3.2電鏡觀察每組取2只兔，1只截取損傷側(cè)和未損傷側(cè)髂腹主動(dòng)脈，約5mm，放入2％戊二醛和1％鋨酸中固定，掃描電鏡觀察動(dòng)脈內(nèi)皮表面形態(tài)，另1只取損傷和未損傷側(cè)髂腹動(dòng)脈約5mm，放入2％戊二醛中固定，透射電鏡觀察平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 2.4免疫組化：采用SP法，DAB顯色方法測(cè)定ICAM-1、VCAM-1、MCP-1在髂動(dòng)脈的表達(dá)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的比率。 2.5 R T-PCR：檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1mRNA在

17、髂腹動(dòng)脈粥樣斑塊處的表達(dá)。 2．6原位雜交用鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)法測(cè)定，地高辛為標(biāo)記，觀測(cè)MCP-lmRNA在髂腹動(dòng)脈中的表達(dá)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的比率。 3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSSll.5軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示。計(jì)量資料各組間用單因素方差分析，兩組間比較用q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料率的比較，用x<'2>檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01具有顯著

18、性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1．血脂影響：8周末模型組TC、LDL-C顯著高于正常組(TC 47.52±21.56，LDL-C43.18±23.35 mmol/L)，阿斯匹林、氯吡格雷不影響血脂；2．血管內(nèi)皮活性物質(zhì)：8周末阿司匹林、氯吡格雷組和阿托伐他汀組血清內(nèi)皮素濃度均降低(ET 100.7±10.3、95.2±7.9、77.8±15.9 ng·ml<'-1>)，一氧化氮濃度均升高(NO 137.3±20.3、135.

19、4±20.7、139.7±23.3 umol·m1<'-1>)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)； 3．血清炎性因子的影響：8周末模型組血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1濃度分別為(279.82±65.19 mg·m1<'-1>、398.1±100.5 ng·ml<'-1>、596.1±130.5ng·ml<'-1>、335.7±82.7/pg·ml<'-1>)水平顯著高于正常組，阿司匹林、氯

20、吡格雷組、阿托伐他汀組可顯著降低(P<0.05，P<0.01)； 4．動(dòng)脈內(nèi)膜厚度和面積的影響：模型組髂動(dòng)脈內(nèi)膜厚度和面積，內(nèi)膜/中膜厚度比、內(nèi)膜/中膜面積比與正常組比較顯著增加(P<0.05)，阿司匹林、氯吡格雷組和阿托伐他汀組內(nèi)膜厚度與內(nèi)膜/中膜厚度比值顯著減少，內(nèi)膜面積與內(nèi)膜/中膜面積比值明顯減少(P<0.05)； 5．細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變：透射電鏡見模型組血管損傷段平滑肌胞體肥大，細(xì)胞核增大，胞漿內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

21、增加，胞內(nèi)吞噬大量脂滴，呈現(xiàn)“合成型”改變，阿司匹林、氯吡格雷組和阿托伐他汀組增生的平滑肌胞體及細(xì)胞核較小，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體較少，較少胞內(nèi)吞噬的脂滴，接近“收縮型”改變；掃描電鏡示模型組內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞連接破壞，有大量血小板和蛋白顆粒粘附；阿司匹林、氯吡格雷組和阿托伐他汀組內(nèi)皮細(xì)胞排列趨于正常，細(xì)胞連接有所恢復(fù)，血小板粘附減少； 6．動(dòng)脈壁ICAM-1、VCAM-1、MCP-1蛋白的變化：模型組ICAM-1、VCA

22、M-1、MCP-1在動(dòng)脈內(nèi)膜的表達(dá)分別為(57.5±6.4)％、(63.8±6.9)％、(19.2±7.4)％，較正常組顯著增加(P<0.05，P<0.01)；阿司匹林、氯吡格雷和阿托伐他汀能明顯降低其表達(dá)： 7．髂動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1 MCP-1mRNA的表達(dá)：模型組顯著高于正常組表達(dá)，分別為(39.4±15.3)％、、(45.4±19.8)％、(39.2±19.7)％，均P<0.05；阿司匹林、氯吡格雷和阿托伐他汀

23、能夠抑制其表達(dá)； 8．氯吡格雷組對(duì)上述指標(biāo)影響與阿托伐他汀無顯著性差異，阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用效果更顯著。 結(jié)論 1.抗血小板制劑對(duì)血脂無影響，可降低炎癥反應(yīng)；同時(shí)可通過降低ET，升高NO，保護(hù)血管內(nèi)皮功能； 2.抗血小板制劑減輕兔髂腹動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜ICAM-1和VCAM-1、MCP-1表達(dá)，抑制血液中自細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移與增殖，阻遏動(dòng)脈內(nèi)膜的增生； 3.血小板抑制劑可以防治動(dòng)脈粥樣