鸚武喙羽病病毒和禽多瘤病毒的全基因組序列分析及鸚鵡喙羽病病毒ORFC1的原核表達(dá).pdf

1、禽多瘤病毒感染癥(Avian Polyomavirus infection，APV感染癥)和鸚鵡喙羽病(Psittacine Beak and Feather Disease，PBFD)被認(rèn)為是影響禽類(lèi)羽毛和外觀的兩大代表性疾病。鸚鵡喙羽病病毒(PBFDV)，屬于圓環(huán)狀病毒科(Circoviridae)環(huán)狀病毒(Circovirus)，可感染約60種的野生及寵物鸚鵡，能引起患烏免疫抑制，危害嚴(yán)重。此病在我國(guó)臺(tái)灣有過(guò)報(bào)道，在大陸還未曾見(jiàn)過(guò)

2、報(bào)道。APV感染癥，又稱鸚鵡幼雛病，主要引起鸚鵡幼雛的急性致死性疾病，其死亡率可高達(dá)100％。本文主要完成了以下工作:
　　 (1)利用PCR方法對(duì)來(lái)自山東的9份瀕死虎皮鸚鵡病料進(jìn)行APV和PBFDV的檢測(cè)，9份病料中有6份PCR檢測(cè)為APV陽(yáng)性，1份檢測(cè)為PBFDV陽(yáng)性，2份為APV和PBFDV混合感染，PCR產(chǎn)物序列分析的結(jié)果可以確認(rèn)本病例鸚鵡有PBFDV和APV的感染，這是我國(guó)大陸首次報(bào)道鸚鵡喙羽病，也是我國(guó)大陸首次報(bào)道虎

3、皮鸚鵡APV和PBFDV的混合感染。
　　 (2)利用分段PCR擴(kuò)增的方法對(duì)APV和PBFDV的全基因組進(jìn)行了擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果分析可知，本文分離到了2株APV分離株，一株為青島株QD-JM01，一株為濰坊株WF-GM01;此外，在青島養(yǎng)殖場(chǎng)還分離到一株P(guān)BFDV分離株QD-CN01，為我國(guó)大陸分離到的第一株P(guān)BFDV。
　　 Blast分析，綜合DNAstar軟件分析可知，APV分離株QD-JM01株和WF-GM01與Ge

4、nBank中全部的APV毒株同源性極高，為99.3％～99.9％。全基因組序列多重比對(duì)分析表明，QD-JM01株共有11處發(fā)生了核苷酸變異，最顯著的是在第246位(非編碼區(qū))插入了14個(gè)堿基，有3處能引起氨基酸的變異。WF-GM01株有14個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基改變，其中VP1變異率最高，有5個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生改變。其次T抗原變異率較高，有4處堿基發(fā)生改變，其中，VP1區(qū)域及T抗原分別有4個(gè)位點(diǎn)引起氨基酸變異。PBFDV青島分離株QD-CN01，全

5、長(zhǎng)2003bp，與GenBank中已發(fā)表PBFDV分離株全序列同源性為83.0％～95.0％。與之前報(bào)道的PBFDV呈現(xiàn)相似的基因組結(jié)構(gòu)，包括主要ORF的大小以及位置，位于Cap和Rep之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列及位置等。利用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析表明這些同源性極高的APV分離株，與地理分布沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)，并不形成地理隔離，與宿主也不呈明顯關(guān)聯(lián);來(lái)源于不同宿主的PBFDV分離株與宿主關(guān)系緊密，與地理來(lái)源也呈一定相關(guān)，我國(guó)的QD-

6、CN01分離株位于由6株分離自日本的分離株構(gòu)成的虎皮鸚鵡特異基因型分支上。
　　 (3)根據(jù)已測(cè)鸚鵡喙羽病病毒青島分離株(QD-CN01)全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)QD-CN01株ORFC1基因(750bp)的引物，將其克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)獲得重組pET-ORFC1質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間，IPTG終濃度，以及菌體OD值進(jìn)行篩選優(yōu)化，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功地在BL21宿主菌中表達(dá)分子量約為28.9kDa的融合蛋白。蛋白