人臍血間充質干細胞定向誘導為類許旺細胞的基因表達學特性研究.pdf

1、背景：周圍神經(jīng)缺損在創(chuàng)傷骨科中較為常見，目前對于大段神經(jīng)缺損主要采用自體神經(jīng)移植修復，但因其局限性無法在臨床中廣泛開展。隨著組織工程學的發(fā)展，利用人工神經(jīng)修復大段神經(jīng)缺損有望成為最佳治療方案。種子細胞即許旺細胞是人工神經(jīng)研究的核心，由間充質干細胞誘導所得的類許旺細胞相對自體、異體許旺細胞而言具有優(yōu)越性，因而成為獲取許旺細胞的相對較好方式。間充質干細胞來源廣泛，如骨髓、臍帶、臍血、脂肪等，臍血間充質干細胞具有自身優(yōu)越性更加吸引研究者。將間

2、充質干細胞誘導為類許旺細胞的過程是通過調節(jié)基因表達以實現(xiàn)誘導目的，通過研究誘導過程中的基因表達學特性，如果能在基因表達學轉錄層面上證明類許旺細胞更接近許旺細胞或了解它們之間的差異，為后期的進一步深入研究提供一定理論依據(jù)。
　　目的：培養(yǎng)人臍血間充質干細胞（HUCBMSCs）、由HUCBMSCs誘導而來的類許旺細胞（類SCs）和許旺細胞（SCs），提取三種細胞mRNA，運用基因芯片技術分析三種細胞的基因在轉錄水平的表達情況，篩選目的

3、基因，說明誘導后的類SCs比較接近SCs。
　　方法：沿用本課題組以往采用的紅細胞沉降、密度梯度離心法提取、純化人臍血中的HUCBMSCs，低酶消化、差速貼壁、條件培養(yǎng)基法提取、純化引產(chǎn)胎兒坐骨神經(jīng)SCs，并通過細胞形態(tài)學觀察、流式細胞儀法對其鑒定及純度測定，達到實驗標準后進行下一步實驗。沿用本課題組前期優(yōu)化的誘導方案將第三代HUCBMSCs誘導為類SCs。三種細胞準備完畢后提取各自mRNA，利用基因芯片技術對其表達基因進行分析，

4、先篩選出HUCBMSCs、類SCs之間的差異表達基因，再將這些差異表達基因與SCs表達基因進行匹配篩選出二者表達無差異性基因，最后在二次篩選且為上調的基因中找出對周圍神經(jīng)損傷修復有意義的基因。選取部分基因進行RT-PCR驗證。
　　結果：1）由HUCBMSCs誘導而來的SCs與誘導前的HUCBMSCs相比存在差異表達基因（含誘導后新表達的基因）數(shù)為6331個，其中上調基因數(shù)為3569個，下調基因數(shù)為2762個，這些差異表達基因除細

5、胞自身分化等因素外可能是誘導引起。2）將上述差異表達基因進行GO富集分析，在細胞組分、分子功能、生物過程三大分類中分別占10.4％、21.2％、68.4％，出現(xiàn)顯著富集的條目主要集中在G蛋白偶聯(lián)受體活性等27個條目中。3）將上述差異表達基因與SCs表達基因相匹配，存在無差異表達基因數(shù)為2265個，說明經(jīng)誘導而來的類SCs在基因表達學轉錄水平方面更接近SCs。4）將上述匹配的基因結果結合相關文獻報道綜合分析，在匹配的上調基因中找出了6個對

6、神經(jīng)損傷修復有一定意義的基因，即S100鈣結合蛋白β、人膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、紐蛋白、早期生長反應因子2、中文名為蛋白激酶Cα、中文名為蛋白激酶Cη。5）在篩選的6個基因中選取2個進行RT-PCR驗證，驗證結果與芯片檢測結果一致。
　　結論：
　　1.本實驗進一步驗證了本課題組對HUCBMSCs及SCs提取方法的可行性。
　　2.從本實驗檢測結果角度看HUCBMSCs經(jīng)誘導后在基因表達學的轉錄水平方面更接近SCs。