EphrinA5在小鼠顆粒細胞中的功能和轉錄組學研究及其蛋白結構分析.pdf

1、本論文試驗研究由三部分組成。第一部分分析肝配蛋白A5（EphrinA5）在小鼠顆粒細胞中的生理作用和信號轉導途徑;第二部分探討肝配蛋白A5的全基因組效應;第三部分分析鼠源肝配蛋白A5及其受體蛋白結構。
　　實驗Ⅰ:肝配蛋白A5對小鼠原代顆粒細胞凋亡和增殖的調控作用及新的信號通路
　　最新研究結果表明，肝配蛋白A5除了作為神經發(fā)生因子發(fā)揮生理作用外，還在雌性小鼠繁殖過程中具有重要生物學作用，但在顆粒細胞(GC)中的生物學作用尚

2、不清楚。GC是研究卵泡發(fā)育基因功能和調控網絡的理想模型。本研究結果表明，肝配蛋白A5的表達在各年齡組小鼠GC中有差異。干擾肝配蛋白A5基因引起mRNA水平和蛋白質水平表達下調，同時抑制E游受體EphA5、Epha3、Epha8和Ephb2的mRNA表達。在體外水平，肝配蛋白A5的下調表達抑制小鼠GC細胞凋亡過程。為了揭示肝配蛋白A5在調控GC凋亡中的作用，本研究進一步分析凋亡因子mRNA和蛋白水平的表達情況，發(fā)現(xiàn)Bax、Tnfα、Cas

3、pase-8和Caspase-3表達下調，而Bcl-2表達上調。這些結果表明，肝配蛋白A5通過Caspase-8介導的內源性途徑參與細胞凋亡。進一步敲低肝配蛋白A5的表達水平，引起Pcna表達上調，隨后激活p-Akt和p-ERK途徑來，促進GC增殖。此外，抑制肝配蛋白A5可增強BMH15、VEGFA和雌二醇mRNA表達水平，并且在不影響孕酮表達水平的情況下抑制GDF9表達，說明其參與卵泡血管生成和卵母細胞發(fā)育調控。綜上所述，肝配蛋白A5

4、調節(jié)雌性小鼠卵泡顆粒細胞凋亡、增殖和類固醇生成過程，因此是雌性生育障礙的潛在治療靶標。
　　實驗Ⅱ:小鼠顆粒細胞肝配蛋白A5干擾后的轉錄組分析
　　肝配蛋白A5是一種肝配蛋白-乙二醇苯醚(ephrin-Eph)信號分子，主要是神經元因子。但最近的研究表明其生理作用超過了神經發(fā)生，其在雌性生殖功能中尤其在卵泡發(fā)育中的作用日益受到關注。肝配蛋白A5與繁殖相關的研究處于初始階段，目前尚未從轉錄組水平報道肝配蛋白A5在卵巢顆粒細胞中

5、的作用。本研究研究利用肝配蛋白A5的siRNA處理小鼠顆粒細胞，然后進行轉錄組測序(RNA-Seq)，以探索肝配蛋白A5干擾后顆粒細胞的全基因組圖譜。RNA-Seq分析結果表明，在小鼠顆粒細胞中檢測到16389個基因，與陰性對照相比，siRNA處理的細胞中有208個基因失調。其中，149個基因下調，59個基因上調。失調的基因主要富集在細胞外過程、鈣結合和細胞粘附。此外，它們主要參與了PI3K-Akt信號轉導途徑、細胞因子-細胞因子受體相

6、互作用、局灶性粘附和Rap1信號轉導途徑等過程。總體而言，干擾肝配蛋白A5改變了調節(jié)卵泡發(fā)生的十多種基因的轉錄水平、調控網絡和生物學過程。本研究為肝配蛋白A5在神經生物學外的雌性生殖中的作用研究提供了新的線索和研究思路。
　　實驗Ⅲ小鼠肝配蛋白A5及其受體的結構分析
　　蛋白質結構對于細胞功能至關重要，因此結構的缺陷可能導致細胞功能紊亂。肝配蛋白A5受體屬于介導細胞通訊過程中最大的一類酪氨酸激酶家族。通過NCBI和蛋白質資源

7、數(shù)據(jù)庫中檢索肝配蛋白A5（Efna5）、肝配蛋白A5受體3(Epha3)、肝配蛋白A5受體5(Epha5)和肝配蛋白A5受體B2(Ephb2)的氨基酸序列，評價和鑒定其蛋白質結構并預測候選蛋白的三維(3D)結構。候選蛋白預測結構存在輕微的構象變化，采用ProSA軟件3D分數(shù)進一步分析預測模型的精度。Efna5、Epha3、Epha5和Ephb2的Verify3D分數(shù)分別為92.75％、94.77％、89.87％和85.96％，說明預測模

8、型結構在可接受質量范圍內。蛋白質結果無序性分析表明Efna5、Ephb3和Ephb2分別存在32.89％、25.4％和27.07％的殘基紊亂。配體結合位點分析結果表明，Efna5、Epha5、Epha3和Ephb2分別存在3、5、4和2個不同的氨基酸殘疾數(shù)目的配體分子。此外，預測到候選蛋白非結合區(qū)的3個結合位點。距離波動分析發(fā)現(xiàn)一些氨基酸殘基在下降和上升的波動中均存在。應用互相關函數(shù)進一步分析發(fā)現(xiàn)這些候選蛋白均存在突變結構。相互作用和通