胎糞吸入誘導(dǎo)新生大鼠急性肺損傷信號通路及西地那非作用的研究.pdf

1、本文主要從以下三部分進(jìn)行論述:
　　第一部分 直視下經(jīng)口氣管插管建立新生大鼠胎糞吸入急性肺損傷模型
　　第二部分 西地那非對胎糞吸入誘導(dǎo)新生大鼠急性肺損傷保護(hù)作用的研究
　　第三部分 胎糞吸入誘導(dǎo)新生大鼠急性肺損傷信號通路及西地那非作用的研究
　　方法：
　　第一部分
　　48只健康雄性新生Wistar大鼠，日齡14～21天，隨機(jī)分為氣管切開組（A組）18只、直視下氣管插管組（B組）24只、正常對照組

2、（C組）6只;B組分為生理鹽水對照組（BN組）、低濃度胎糞組（BL組）、中濃度胎糞組（BM組）、高濃度胎糞組（BH組），每組6只。A、B組大鼠苯巴比妥鈉腹腔麻醉，A組氣管切開，插管后呼吸機(jī)輔助呼吸;B組直視下經(jīng)口氣管插管，1分鐘拔管，自主呼吸。
　　第二部分
　　24只新生健康雄性western大鼠，日齡14～21天，隨機(jī)分為生理鹽水對照組(C組)、胎糞吸入組（M組）、地塞米松組（D組）、西地那非組（S組），直視下氣管插管，

3、氣管內(nèi)注液2ml/kg，C組注入生理鹽水，其余三組注入胎糞，濃度為60mg/L。
　　第三部分
　　48新生健康雄性western大鼠，日齡14～21天，隨機(jī)分為8組，生理鹽水對照組（C組）、胎糞吸入組（M組）、西地那非組（S組），ERK抑制劑組(PD組)、P38抑制劑組（SB組）、JNK抑制劑組（SP組）、PI3K抑制劑組（W組），因各組抑制劑均用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，故設(shè)立溶劑

4、對照組DMSO組（D組）。各組予腹腔注射，劑量5ml/kg，C組、M組、S組為磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）;其余組用PBS稀釋試劑至相應(yīng)濃度。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1、建模成功率
　　A組18只大鼠中，3只(3/18)成活到氣管插管后6小時，建模成功率16.67％。B組22只(22/24)建模成功，成功率91.67％。BH組死亡2只。兩組建模成功率比較X=2

5、4.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　2、肺組織濕/干重比
　　各組大鼠肺組織濕/干重比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.48，P＜0.01)。與C組相比，BN組略高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;然后由低至高依次為BL組、BM組、A組，BH組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);BH組最高，但與A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、病理結(jié)果
　　各組大鼠肺組織病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F

6、=51.31，P＜0.01）。C組最低，然后是BN組，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); BL組、BM組均高于BN組(P＜0.05)，BM組高于BL組(P＜0.01)，低于BH組及A組(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組最高，但與BH組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　第二部分
　　1、病理評分
　　各組間病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.46，P＜0.01)。M組最高，高于D組、S組(P＜0.05

7、)，C組(P＜0.01)，D組、S組高于C組(P＜0.01)。
　　2、氧化應(yīng)激及炎癥因子
　　M組MPO、NO、MDA濃度最高，高于D組、S組、C組(P＜0.01)，D組、S組高于C組(P＜0.01)。M組SOD濃度最低，低于C組、D組、S組(P＜0.01)，C組低于D組、S組(P＜0.01)。
　　3、細(xì)胞凋亡
　　M組凋亡指數(shù)（TUNEL法）、Bax蛋白和基因的表達(dá)最高，高于C組、D組、S組(P＜0.01)

8、，D組、S組高于C組(P＜0.01);C組Bcl-2/Bax蛋白和基因、Bcl-2蛋白和基因的表達(dá)最低，低于M組、D組、S組(P＜0.01)，M組低于D組、S組(P＜0.01);D、S兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4、血清cAMP、cGMP濃度
　　D組cAMP最高，高于S組、M組、C組(P＜0.01)，S組高于M組(P＜0.05)、C組(P＜0.01)，M組高于C組(P＜0.05);S組cGMP最高，D組

9、高于M組及C組(P＜0.01)，M組、C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　第三部分
　　1、病理評分
　　SB組、SP組和S組炎癥表現(xiàn)較輕，M組、D組、W組及PD組炎癥表現(xiàn)較重。各組間病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.23，P＜0.01)。
　　2、血清TNF-a濃度檢測
　　各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.87，P＜0.01)。SB組、SP組、S組較C組升高(P＜0.01)，較M組降低(P＜0

10、.01)，三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PD組和W組較M組升高(P＜0.05)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、肺組織中p-P38、p-ERK1/2、p-JNK及p-Akt蛋白的表達(dá)
　　3.1 p-P38蛋白的表達(dá)
　　免疫組化法檢測顯示，胎糞刺激后M組可見p-P38陽性細(xì)胞增多，尤其在浸潤的中性粒細(xì)胞中多見。給予P38抑制劑及西地那非后，均可見p-P38陽性細(xì)胞減少。Western blot檢測顯示，

11、組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.28，P＜0.01)。SB組和S組較C組升高（P＜0.01），較M組、D組降低(P＜0.01)，SB組和S組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.2 p-ERK1/2蛋白的表達(dá)
　　正常對照組可見少量陽性細(xì)胞，胎糞刺激后，M組、D組呈陽性表達(dá)，主要為中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，在細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒沉積。ERK1/2抑制劑干預(yù)后，p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯減少;西地那非干預(yù)后，p-ERK

12、1/2蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)。Western blot檢測顯示，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=124.28，p＜0.01)。PD組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05），低于M組、D組(p＜0.01）;S組高于M組及D組(p＜0.05)。
　　3.3 p-JNK蛋白的表達(dá)
　　免疫組化檢測顯示，西地那非及JNK抑制劑干預(yù)后，肺組織內(nèi)p-JNK表達(dá)很弱，與C組相似，M組、D組可見陽性表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)及部分細(xì)胞核內(nèi)棕黃色。Weste

13、rn blot檢測顯示，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=119.96，p＜0.01)。C組、SP組、S組肺組織p-JNK表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，均低于M組、D組(p＜0.01)。
　　3.4 p-Akt蛋白的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示，C組及PI3K抑制劑作用后新生大鼠肺組織可見弱陽性表達(dá)，W組、D組呈陽性表達(dá)，給予西地那非后S組可見陽性表達(dá)明顯，細(xì)胞內(nèi)見棕黃色顆粒。Western blot檢測顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、(F=57.26，p＜0.01)。C組和W組最低;S組高于M組、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、傳統(tǒng)的氣管切開氣管插管方法對新生大鼠組織損傷大，操作復(fù)雜，需要小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，建模成功率低，并可導(dǎo)致應(yīng)激性肺損傷，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們通過直視下經(jīng)口氣管插管建立新生大鼠胎糞吸入模型，建模成功率高，無應(yīng)激性肺損傷。同時確定濃度為60mg/ml的胎糞混懸液可導(dǎo)致新生大鼠肺組織典型而廣泛的病理改變。

15、r>　　2、炎癥因子、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡參與了胎糞吸入誘導(dǎo)新生大鼠急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制;西地那非可抑制炎癥因子的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激損傷;增加Bcl-2的表達(dá)，減少Bax的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕MAS導(dǎo)致的ALI的病理損傷。西地那非可能通過增加cGMP和cAMP的活性發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
　　3、MAPKs信號通路中的P38、ERK1/2、JNK及PI3K/Akt信號通路均參與了新生大鼠MAS誘導(dǎo)的

16、ALI的病理過程。P38 MAPK通路和JNK MAPK通路可能通過增加炎癥因子TNF-a的表達(dá)加重肺組織病理損傷，ERK1/2 MAPK通路和PI3K/Akt通路可減少TNF-a的表達(dá)從而減輕病理損傷。西地那非在MAS誘導(dǎo)新生大鼠ALI的動物模型中，可影響信號通路，抑制肺組織p-P38及p-JNK蛋白的表達(dá)，增加p-ERK1/2和p-Akt蛋白的表達(dá)，具有一定的肺保護(hù)作用。
　　創(chuàng)新及意義：
　　1、本研究通過直視下經(jīng)口氣

17、管插管建立新生大鼠胎糞吸入模型，建模成功率高，無應(yīng)激性肺損傷。同時確定濃度為60mg/ml的胎糞混懸液適宜用來建立新生大鼠MAS模型。
　　2、本研究明確西地那非通過減輕氧化應(yīng)激、減少炎癥因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡等對MAS誘導(dǎo)新生大鼠ALI具有肺保護(hù)作用，為臨床使用西地那非治療ALI提供理論依據(jù)。
　　3、本研究明確了MAPKs(P38、JNK、ERK1/2)及PI3K/Akt信號通路均參與了新生大鼠MAS誘導(dǎo)的ALI的病理