解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種的分離鑒定及致病性與大環(huán)內(nèi)酯耐藥機(jī)制研究.pdf

1、解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種(Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus)即牛鏈球菌Ⅱ/2(Streptococcus bovis II/2)，是一種重要的醫(yī)院內(nèi)傳染病原，主要感染初生嬰兒，致嬰兒的腦膜炎、菌血癥等，甚至死亡;多種動(dòng)物也可以被解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種感染，且死亡率較高。2010年至2013年間，湖北及廣西等地六個(gè)規(guī)模化鴨場(chǎng)～10日齡雛鴨突然發(fā)病，死亡率約20％。本研究從死亡雛鴨

2、的腦、脾組織分離了六株細(xì)菌，經(jīng)純化培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，并以AL101002菌株為代表研究其致病機(jī)制，此外還對(duì)六株菌的大環(huán)內(nèi)酯耐藥機(jī)制進(jìn)行了深入研究。研究結(jié)果如下:
　　1.解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種的分離鑒定
　　分離細(xì)菌純化培養(yǎng)后，革蘭氏染色呈陽(yáng)性球菌，排列方式為單個(gè)或短鏈狀，蘭氏抗原分群鑒定為D群，生化特性鑒定為解沒(méi)食子酸鏈球菌，結(jié)合16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果，六株分離菌鑒定為解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種（S.ga

3、llolyticus subsp.pasteurianus），依次命名為AL101002、GX130304、GX130304、GX130630、GX130723、GX130809。采用頸部皮下途徑分別感染上述六株菌，均可以致雛鴨死亡，發(fā)病癥狀、死亡率、病理變化等與自然感染相似。以AL101002為代表進(jìn)行研究，石蠟切片革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)在感染雛鴨肝臟的肝竇及內(nèi)皮細(xì)胞、脾臟的巨噬細(xì)胞、腎臟的腎小球內(nèi)存在大量革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用針對(duì)AL10100

4、2的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，證明存在于這些部位的細(xì)菌為解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種;雛鴨脾臟的超微組織學(xué)病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在脾臟的巨噬細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)復(fù)制狀的球菌。綜合上述結(jié)果，本研究分離到的六株菌為解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種。
　　2.解沒(méi)食子酸鏈球菌的致病機(jī)制
　　以AL101002菌感染7日齡雛鴨，動(dòng)態(tài)研究雛鴨發(fā)病機(jī)制:感染后5d，雛鴨表現(xiàn)出典型臨床癥狀，發(fā)病率為100％，死亡率為52.38％(22/42)。AL101002

5、菌株感染雛鴨后1-5d，各器官及血液均可以分離到接種菌，5d之后血液分離不到細(xì)菌，7d只有腎和法氏囊可以分離到細(xì)菌。剖檢病理變化可見(jiàn)脾臟腫大、心包膜增厚，外觀呈絨毛狀，肝臟表面干酪樣物質(zhì)滲出，嚴(yán)重的腦膜充血。組織病理學(xué)變化為:感染后5d，脾臟基本結(jié)構(gòu)消失，實(shí)質(zhì)性心肌炎;感染后7d，法氏囊的淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少;感染后3-9d，腦膜炎癥狀程度不等;其他組織出現(xiàn)異嗜性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫器官指數(shù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)脾臟的影響最大。TUNE

6、L法檢測(cè)脾臟的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明感染組的脾臟細(xì)胞凋亡明顯，且差異顯著。感染雛鴨的超微組織學(xué)病理變化結(jié)果顯示:感染后1-5d，脾臟巨噬細(xì)胞可見(jiàn)復(fù)制狀球菌，并且在感染后5d，可見(jiàn)脾臟巨噬細(xì)胞壞死的特性;抗CD68抗體，一種巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物，檢測(cè)脾臟的巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明在脾臟壞死灶周?chē)梢?jiàn)陽(yáng)性信號(hào)。熒光定量PCR檢測(cè)腦組織的TNF-α、IL-1β及脾組織的Caspase-3、Caspase-8、RIPK1、RIPK2-like、MLKL

7、、TNF-α，IL-1β、IL-6的變化，結(jié)果表明:腦組織的兩個(gè)致炎因子表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明腦膜炎的發(fā)生;脾臟組織的兩個(gè)關(guān)鍵凋亡因子基本無(wú)變化，相反壞死性凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子RIPK1和MLKL在感染后5d分別上調(diào)表達(dá)～2.5倍，炎性因子IL-1β、IL-6上調(diào)表達(dá)顯著，表明脾臟的急性炎癥。由此可見(jiàn)解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種靶標(biāo)雛鴨的免疫器官及腦，致雛鴨脾臟巨噬細(xì)胞的壞死性凋亡，可以侵入雛鴨的腦實(shí)質(zhì)，致嚴(yán)重的腦膜炎癥狀。
　　3.解沒(méi)食子酸鏈

8、球菌的耐藥特征及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥機(jī)制
　　采用瓊脂稀釋法檢測(cè)六株解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種的MIC值，結(jié)果表明六株菌均表現(xiàn)出多重耐藥，尤其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物呈現(xiàn)高水平耐藥，紅霉素與克拉霉素的MIC值分別高達(dá)1024 mg/L和512 mg/L。
　　大環(huán)內(nèi)酯耐藥機(jī)制研究結(jié)果如下:
　　A.未能檢測(cè)到任何質(zhì)粒、mefA或mef基因，PAβN或CCCP外排泵抑制劑未能顯著影響大環(huán)內(nèi)酯MIC值，表明大環(huán)內(nèi)酯耐藥并非由外排系統(tǒng)所致;

9、
　　B.核糖體蛋白L4和L22無(wú)任何氨基酸的突變，23S rRNA序列上有點(diǎn)突變，而這些突變位點(diǎn)導(dǎo)致的大環(huán)內(nèi)酯耐藥MIC值≤32 mg/L，表明這些分離株中的大環(huán)內(nèi)酯高水平耐藥并非由核糖體蛋白L4和L22或23S rRNA突變導(dǎo)致;
　　C.PCR檢測(cè)到六株菌基因組上均有核糖體甲基化酶基因ermB和ermT，以及四環(huán)素耐藥基因tetM和tetL，其中四株菌含有林可酰胺類(lèi)耐藥基因Lnua，一株菌含有慶大霉素耐藥基因。對(duì)AL1

10、01002菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上擴(kuò)增ermB及ermT因的上下游序列，發(fā)現(xiàn)AL101002基因組含有兩個(gè)耐藥基因簇，分別長(zhǎng)5.731 kb和11.244 kb，短基因簇含有ermB基因，長(zhǎng)基因簇含有ermT，二者Genbank的登錄號(hào)分別為KU511281和KU511280。
　　D.ermB與ermT在六株菌的誘導(dǎo)表達(dá):
　　Western blot檢測(cè)六株菌的紅霉素耐藥甲基化酶ErmB和ErmT在紅霉素存在

11、與否時(shí)的表達(dá)，結(jié)果表明在紅霉素存在時(shí)，兩個(gè)紅霉素耐藥甲基化酶在六株菌中均可表達(dá)，當(dāng)紅霉素不存在時(shí)，六株菌均不表達(dá)這兩個(gè)甲基化酶;進(jìn)一步在E.coli里檢測(cè)含有His標(biāo)簽的這兩個(gè)甲基化酶融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明添加一定量的紅霉素，兩個(gè)甲基化酶均可以表達(dá)，紅霉素不存在時(shí)，ErmB和ErmT表現(xiàn)出有少量表達(dá)，可能是和啟動(dòng)子的泄漏有關(guān)。
　　E.ermB和ermT對(duì)大環(huán)內(nèi)酯高水平耐藥的貢獻(xiàn):
　　測(cè)兩個(gè)耐藥基因共存和單獨(dú)存在時(shí)對(duì)大環(huán)

12、內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥貢獻(xiàn)，結(jié)果表明，二者共存時(shí)，無(wú)論有無(wú)前導(dǎo)肽(leader peptide)，所有測(cè)試的大環(huán)內(nèi)酯藥物的MIC值都高于單獨(dú)存在時(shí)的MIC值。無(wú)論二者共存還是單獨(dú)表達(dá)，無(wú)leader peptide時(shí)的MIC值都是是含leader peptide時(shí)的兩倍，且二者共存并有l(wèi)eader pepetide時(shí)的MIC值與六株臨床分離株的大環(huán)內(nèi)酯MIC值相當(dāng);說(shuō)明六株菌的大環(huán)內(nèi)酯高水平耐藥是由ermB和ermT基因共存導(dǎo)致，且leade

13、r peptide對(duì)其下游的erm基因具有衰減調(diào)控的作用。
　　綜合上述研究結(jié)果，本論文得到的結(jié)論如下:
　　A.首次從雛鴨的腦及脾臟組織分離并鑒定了六株解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種，發(fā)現(xiàn)解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種可導(dǎo)致雛鴨腦膜炎及脾臟巨噬細(xì)胞壞死性凋亡，并可導(dǎo)致較高的雛鴨死亡率。
　　B.首次發(fā)現(xiàn)解沒(méi)食子酸鏈球菌巴氏亞種基因組含有紅霉素耐藥基因核糖體甲基化酶ermB和ermT,并發(fā)現(xiàn)二者受紅霉素誘導(dǎo)表達(dá)，且二者的誘導(dǎo)表達(dá)是