魚類鏈球菌的分離，鑒定和診斷技術(shù).pdf

1、魚類鏈球菌是近來年在水產(chǎn)養(yǎng)殖上出現(xiàn)的重要病原菌，對海水魚類的危害僅次于弧菌。80年代初曾在日本大規(guī)模流行，主要危害養(yǎng)殖鰤魚、牙鲆、真鯛、暗紋東方鲀、銀鮭等。90年代后，魚類鏈球菌病在美國、以色列、日本、韓國、等國發(fā)生，成為近年來給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失的重要疾病，全世界每年因鏈球菌感染引起的經(jīng)濟損失已超過1.5億美元。
　　 海豚鏈球菌是魚類鏈球菌中的一個重要種，可危害多種養(yǎng)殖魚類，同時還可可引起人類感染，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中少

2、數(shù)幾個有人類感染風(fēng)險的病原菌之一。1991年在美國確診了第一例人類海豚鏈球菌感染后，至今全世界至少有30人確診為海豚鏈球菌感染。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展和人們對水產(chǎn)品需求量的增加，魚類鏈球菌感染和人類海豚鏈球菌存在上升的趨勢。
　　 本論文采用加有0.04％疊氮鈉的BHI、TSB、TH、SF四種液體培養(yǎng)基結(jié)合BHI固體培養(yǎng)基對人工感染黃顙魚的9個部位進行鏈球菌的分離培養(yǎng)，確定以BHI 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對鏈球菌的培養(yǎng)效果最好；

3、腦、腎、血液為最好的分離部位。選擇了噁喹酸鈉、硫酸粘桿菌素及鏈霉素三種抗生素作為雜菌抑制劑，通過三種抑菌劑對不同濃度海豚鏈球菌的抑制效果確定三種抑菌劑的使用濃度分別為0.06mg/mL、0.012mg/mL和25U/mL，噁喹酸與硫酸粘桿菌素的配比為1：2，研制了鏈球菌選擇性培養(yǎng)基——噁喹酸、硫酸粘桿菌素BHI培養(yǎng)基（BHICSOA），用該培養(yǎng)基對豬鏈球菌SS25995、海豚鏈球菌NUF693、擬態(tài)弧菌SsN0608、氣單胞菌MrM06

4、02及魚體樣品進行鏈球菌培養(yǎng)，結(jié)果表明，BHICSOA培養(yǎng)基可有效抑制雜菌，對鏈球菌具有較強的選擇性，初步可作為鏈球菌的選擇性培養(yǎng)基。
　　 用BHICSOA培養(yǎng)基對市售常見水產(chǎn)動物黏液和鰓、內(nèi)臟進行了鏈球菌的分離培養(yǎng)，共分離36株鏈球菌類菌株，對部分菌株進行了動物回感和對小鼠的致病性試驗，結(jié)果表明MrS3和TS對宿主有一定的致病性，海水魚分離株6?？梢鹦∈竽X膜炎，嚴重影響了小鼠的正常生長；36株菌中有20株有溶血性，其中14

5、株為典型的β溶血。采用API 20STREP對部分分離株進行了生化鑒定，發(fā)現(xiàn)分離菌株主要有淺綠色鏈球菌、乳房鏈球菌、豕鏈球菌、無乳鏈球菌等，少數(shù)菌株因API系統(tǒng)參考菌株性狀不夠未能定種；用針對tuf基因的鏈球菌屬特異性引物對36株分離鏈球菌菌株進行進行了PCR擴增，有30株菌為擴增陽性，表明tuf基因可作為鏈球菌屬鑒定基因；建立了基于海豚鏈球菌LctO和16SrRNA基因的種特異性PCR鑒定法，該法可有效用于海豚鏈球菌的鑒定，30株tu

6、f陽性菌株中未發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌菌株。
　　 以海豚鏈球菌SO3為抗原制備了兔高效免疫血清，間接ELISA效價為1：20480，經(jīng)親和層析、硫酸銨濃縮、活化生物素標(biāo)記，制備了生物素標(biāo)記兔抗海豚鏈球菌抗體，成功建立了雙夾心生物素抗體-鏈酶親和素ELISA檢測法(BA-ELISA法)，該方法對海豚鏈球菌特異性強，對豬鏈球菌、葡萄球菌等其他水產(chǎn)常見細菌無非特異性反應(yīng)，最低檢測限度為4~16×104cfu，適用于海豚鏈球菌的檢測；BA-EL

7、ISA還可用于對魚體鰓和黏液混合物的直接檢測，與PCR 的檢測法一致性為86.1％，表明該法可作為基層單位用于海豚鏈球菌的快速檢測。
　　 采用鏈球菌選擇性培養(yǎng)基對浙江省主要海水和淡水養(yǎng)殖魚類及部分市售海捕魚類的鰓和體表進行了初步的分離和培養(yǎng)，結(jié)合PCR鑒定技術(shù)，對魚體攜帶海豚鏈球菌的基本情況進行了初步的調(diào)查。結(jié)果表明：
　　 1）湖州、溫州、舟山和三門等地的淡水和海水魚類體表和鰓均有海豚鏈球菌的檢出，檢出率為10.6％

8、-47.5％不等。
　　 2)水產(chǎn)品市場和酒店魚類的海豚鏈球菌檢測率分別為30.9％和35.6％，表現(xiàn)較高的檢出率。
　　 3）海豚鏈球菌檢出率比例較高的海水魚類為石首魚科、帶魚科、鯔科、鰨科和鮨科魚類，淡水養(yǎng)殖魚類中海豚鏈球菌的檢出率較高的養(yǎng)殖品種主要為羅非魚、烏鱧、鱸魚、黃顙魚和鯰魚。
　　 4）養(yǎng)殖魚類海豚鏈球菌檢出率高于野生魚類，體表黏液比鰓更易檢出海豚鏈球菌。上述結(jié)果表明常見的養(yǎng)殖和野生魚類中存在較高的