NF-H在糖尿病大鼠胼胝體的表達(dá)及與認(rèn)知障礙研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)病變是1型糖尿病和2型糖尿病的主要并發(fā)癥之一，人類把越來(lái)越多的精力投入到周圍神經(jīng)病的病因?qū)W和病理學(xué)研究中，而對(duì)中樞神經(jīng)病變只有簡(jiǎn)單的描述。近年來(lái)，由糖尿病引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害日益受到人們的重視。中樞神經(jīng)病變以腦電傳導(dǎo)速度的下降、腦組織萎縮、認(rèn)知能力減退、和卒中風(fēng)險(xiǎn)升高為特征。許多研究顯示糖尿病增加了阿爾茨海默病和其他類型癡呆的風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，亦缺乏有效的防治手段。
　　早在40多年

2、前就有學(xué)者提出糖尿病腦病的概念，但至今尚無(wú)此病的診斷標(biāo)準(zhǔn)和特異性輔助檢查手段；其臨床主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力、記憶力、理解判斷力、表達(dá)能力等下降。這種糖尿病相關(guān)的認(rèn)知功能障礙可能是由于持續(xù)的高血糖直接損傷腦組織神經(jīng)細(xì)胞引起，隨著病程的延長(zhǎng)，各種致病因素將參與進(jìn)來(lái)共同作用，加劇認(rèn)知障礙的進(jìn)展。目前研究證實(shí)葡萄糖的多元醇通路激活(polyol pathway)、氧化應(yīng)激、非酶促糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end prod

3、ucts，AGEs)堆積、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活、己糖胺途經(jīng)激活、低度炎癥狀態(tài)、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、肌醇耗竭、Na+，K+-ATPase活性降低、游離脂肪酸代謝異常、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、血液凝固及纖維蛋白溶解系統(tǒng)活性異常等各種相關(guān)因素相互影響引起神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，從而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。
　　完整的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是執(zhí)行一切功能的基礎(chǔ)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通路越完整，其信息傳送量越大，越有利于功能的完成。神

4、經(jīng)絲蛋白(neurofilament，NF)是神經(jīng)元的骨架蛋白，構(gòu)成神經(jīng)通訊網(wǎng)絡(luò)的基本結(jié)構(gòu)；胼胝體是連合左右半球新皮質(zhì)的聯(lián)合纖維，主要與基本的認(rèn)知能力有關(guān)，包括記憶力、注意力、表達(dá)能力和智力等，胼胝體前部(額區(qū))主要聯(lián)系兩側(cè)額葉，有資料顯示大腦額葉皮質(zhì)是與學(xué)習(xí)和記憶功能較為密切的區(qū)域。
　　因此，我們推測(cè)NF-H在糖尿病大鼠胼胝體前部的表達(dá)會(huì)有變化并可能和認(rèn)知功能的障礙程度有一定的相關(guān)性。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)采用空腹腹腔單次注

5、射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法，建立SD大鼠糖尿病模型，觀察高分子量神經(jīng)絲蛋白(high-neurofilament，NF-H)在實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型胼胝體前部的表達(dá)變化情況，觀察糖尿病大鼠胼胝體前部的病理學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)變化，觀察糖尿病大鼠的認(rèn)知功能損害，進(jìn)一步對(duì)不同病程時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)作相關(guān)性分析，探討糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能損害的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：(1)實(shí)驗(yàn)分組：采用健康成年雄性Sprague-Dawl

6、ey大鼠，隨機(jī)分為2組：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病組(DM組)和對(duì)照組(CON組)。每組按照模型建立成功后的時(shí)間分為4周、7周、10周、13周4個(gè)亞組。(2)模型制備：DM組大鼠禁食12小時(shí)后給予腹腔內(nèi)注射以STZ65mg/kg體重，72小時(shí)出現(xiàn)多飲、多食、多尿，非空腹血糖≥16.7mmol/L者表示造模成功。CON組腹腔內(nèi)注射等體積pH4.0的檸檬酸緩沖液。(3)取材及樣品制備：①蠟塊樣品制備：各亞組

7、大鼠在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、稱重、測(cè)血糖后，麻醉，以4％多聚甲醛全身灌流固定，斷頭取腦，后固定，石蠟包埋，改良三色法特殊染色，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NF-H的表達(dá)；②電鏡樣品制備：以4％多聚甲醛和2.5％戊二醛混合液灌流固定，斷頭取腦，取1mm3大小胼胝體前部組織立即放于4％戊二醛固定，之后經(jīng)1％餓酸后固定，丙酮脫水、浸透，包埋，半薄切片定位分析，超薄切片，醋酸鈾.枸櫞酸鉛電子染色，透射電鏡(JEM-1230型)觀察并拍照。

8、(4)Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改良三色染色法觀察胼胝體病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色觀察NF-H表達(dá)情況，電鏡觀察胼胝體神經(jīng)纖維的超微結(jié)構(gòu)改變。(5)統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±S)表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn)、單因素方差分析(one-way ANOVA)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，Pearson線性相關(guān)分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取a=0.05。
　　結(jié)果：

9、>　　1、各亞組DM組大鼠較相應(yīng)CON組大鼠體重水平顯著降低；各亞組DM大鼠較相應(yīng)CON組大鼠血糖水平顯著升高；
　　2、10周組中DM組大鼠較CON組大鼠的潛伏期時(shí)間顯著延長(zhǎng)；DM組中7周組、10周組分別較4周組潛伏期時(shí)間顯著延長(zhǎng)、搜索策略評(píng)分顯著降低；7周組、10周組中DM組分別較CON組的搜索策略評(píng)分、平臺(tái)穿越次數(shù)和站臺(tái)周邊區(qū)域Ⅰ-Ⅳ內(nèi)活動(dòng)時(shí)間顯著減少；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)成績(jī)?cè)贑ON組各亞組大鼠之間比較無(wú)顯著性差異。

10、r>　　3、(1)改良三色染色法：CON組大鼠胼胝體前部神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)未見(jiàn)破壞，DM4周時(shí)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)破壞不明顯，其他DM組均可見(jiàn)神經(jīng)軸突和髓鞘不同程度的破壞，結(jié)構(gòu)層次紊亂，表現(xiàn)為軸突稀疏、增粗、著色不均減少、排列松散不規(guī)整，神經(jīng)髓鞘著色減少、大量空泡形成。(2)透射電鏡觀察：CON組大鼠胼胝體前部神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)未見(jiàn)破壞，DM組均可見(jiàn)神經(jīng)軸突和髓鞘不同程度的破壞，結(jié)構(gòu)層次紊亂，疏松或崩解。表現(xiàn)為不同程度的髓鞘松散，軸索萎縮、固縮。
　

11、　4、NF-H的表達(dá)在各亞組DM組大鼠較相應(yīng)CON組大鼠顯著降低；DM組中10周組和13周組分別較4周組和7周組顯著降低；CON組各亞組間比較無(wú)顯著差異。
　　5、NF-H的表達(dá)與病程具有顯著相關(guān)性(r=-0.983，p=0.017)；潛伏期、搜索策略評(píng)分、平臺(tái)穿越次數(shù)和站臺(tái)周邊區(qū)域Ⅰ-Ⅳ內(nèi)活動(dòng)時(shí)間與病程無(wú)顯著相關(guān)性(p>0.05)；NF-H的表達(dá)分別與潛伏期、搜索策略評(píng)分、平臺(tái)穿越次數(shù)和站臺(tái)周邊區(qū)域Ⅰ-Ⅳ內(nèi)活動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)性(