用于快速檢測豬瘟抗體雙功能分子的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、豬瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由豬瘟病毒引起的豬的一種急熱性、致死性疾病。給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對豬瘟抗體進(jìn)行定期監(jiān)測對豬瘟的防制具有重要意義，針對目前還沒有一種適合基層單位使用的、簡便、快速、穩(wěn)定的豬瘟抗體檢測方法的現(xiàn)狀，本項(xiàng)目根據(jù)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的原理開展用于快速檢測豬瘟抗體的雙功能試劑方面的研究。研究主要結(jié)果如下： 1、雙功能分子的拼接及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建采用重疊延伸拼接(SOE)

2、PCR的方法將2E8ScFv(抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因)和mE2(豬瘟E2基因主要抗原區(qū)基因)拼接成融合雙功能分子，命名為2E8mE2，將融合基因克隆入PMD18-T Simple載體，測序正確后，再亞克隆入PET-DsbA原核表達(dá)載體，通過PCR和酶切鑒定，均能獲得大約1125bp的目的條帶。表明原核表達(dá)載體PET-DsbA-2E8mE2構(gòu)建成功。 2、2E8mE2重組蛋白的表達(dá)將PET-DsbA-2E8mE2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

3、BL21(DE3)PlysS原核表達(dá)菌株，用常規(guī)方法進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)超聲波裂解，SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的性質(zhì)，然后通過不同的溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間的梯度來篩選最佳表達(dá)條件。結(jié)果表明：2E8mE2重組蛋白獲得了高效表達(dá)，占細(xì)菌總量的30％；表達(dá)產(chǎn)物大部分是以不溶的包涵體形式存在；在37℃，IPTG濃度為0.3mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為3h的條件下重組蛋白可獲得最佳表達(dá)。分別用6×His單克隆抗體和CSFV高免血清對表達(dá)的重組蛋白

4、進(jìn)行Western-blot檢測，結(jié)果顯示：重組蛋白與6xHis單克隆抗體及CSFV陽性血清均呈陽性反應(yīng)，呈現(xiàn)清晰的特異性反應(yīng)條帶，而空載體誘導(dǎo)菌的菌體蛋白無上述反應(yīng)條帶。表明所表達(dá)的重組蛋白是特異的。 3、2E8mE2重組蛋白包涵體的復(fù)性及檢測超聲波破碎處理重組菌，收集重組蛋白包涵體，用0.5％TritonX-100和1mol/L NaCl洗滌包涵體后用尿素溶解，利用Ni-NTA樹脂對溶解的蛋白進(jìn)行親和層析純化，然后利用谷胱甘