共表達輔助蛋白促進釀酒酵母異源蛋白分泌.pdf

1、釀酒酵母是食品級安全性真菌，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。釀酒酵母細胞具有完善的蛋白質(zhì)加工體系，確保蛋白質(zhì)的折疊、翻譯后修飾，目前已有多種藥物蛋白由釀酒酵母生產(chǎn)。然而，釀酒酵母對異源蛋白的分泌水平普遍較低，嚴重制約了其的工業(yè)化應(yīng)用。提高釀酒酵母分泌水平的方法主要是優(yōu)化發(fā)酵和從基因?qū)用嬲{(diào)節(jié)異源蛋白分泌。目前釀酒酵母異源蛋白基因?qū)用嫔系姆置诓呗灾饕孕》肿拥鞍踪|(zhì)為研究對象，對30KDa以上的蛋白質(zhì)種類研究較少。本文以漆酶(53KDa)為

2、例，嘗試尋找一系列適合較大分子的分泌表達策略。
　　本文通過在釀酒酵母中優(yōu)化漆酶的啟動子、信號肽和共表達與異源蛋白合成和分泌相關(guān)的蛋白質(zhì)（簡稱“輔助蛋白”），使漆酶的胞外分泌水平提高，還發(fā)現(xiàn)輔助蛋白組合可提高α-淀粉酶和增強型綠色熒光蛋白EGFP的分泌水平，具有一定的普遍適用性。具體研究如下:
　　1、選擇啟動子TEF1和GAL1，構(gòu)建并發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)酶菌株，以了解漆酶在釀酒酵母胞內(nèi)的表達情況;在此基礎(chǔ)上引入α-因子信號肽，構(gòu)建

3、產(chǎn)胞外酶菌株，發(fā)酵并測定胞內(nèi)外酶活，純化蛋白后跑SDS-PAGE，考察各菌株的漆酶表達水平。結(jié)果表明:所選漆酶基因能在釀酒酵母胞內(nèi)表達和胞外分泌。在T=72h，啟動子GAL1對應(yīng)菌株的漆酶胞外酶活高于啟動子TEF1對應(yīng)菌株，分別為129.73±2.57U/L和30.52±2.56U/L。因此，選GAL1為胞外產(chǎn)酶菌的啟動子用于后續(xù)實驗。
　　2、選取釀酒酵母天然α-因子信號肽、菊粉酶天然信號肽、合成信號肽以及漆酶天然信號肽，比較其

4、介導(dǎo)的漆酶分泌效果。合成信號肽介導(dǎo)的漆酶胞外酶活和分泌率較α-因子信號肽分別提高了1.39倍和99％，另外兩種信號肽對應(yīng)菌株未檢測到胞外酶活。綜合考慮胞外酶活和分泌率，確定合成信號肽用于后續(xù)實驗。
　　3、選取八個輔助蛋白，將其過表達，考察對漆酶分泌的作用。結(jié)果表明RPP0、SSO2、BIP、PDI四個輔助蛋白使漆酶胞外酶活和分泌率提高，其胞外酶活依次下降。其中RPP0過表達的菌株B/pGSLC-yPRP的胞外酶活為444.24±

5、2.82U/L，分泌率為25.73±0.73％，分別較空白對照B/pGSLC-YEplac181提高了69％和46％。
　　4、考察分泌效果較好的PDI、BIP、SSO2和RPP0四個輔助蛋白間的協(xié)同作用。結(jié)果表明RPP0和SSO2，RPP0和BIP，RPP0和SecI三組蛋白存在促進蛋白胞內(nèi)表達和胞外分泌的協(xié)同作用。其中，RPP0和SSO2的協(xié)同作用對漆酶分泌最顯著，其胞外酶活為585.21±1.28U/L，分泌率為30.36±

6、0.71％，較過表達RPP0的菌株B/pGSLC-yPRP分別提高了31％和18％，較空白對照B/pGSLC-YEplac181分別提高了1.23倍和73.19％。
　　5、考察輔助蛋白RPP0和SSO2共表達對提高其他異源蛋白分泌水平的普遍適用性。結(jié)果表明RPP0和SSO2共表達使得菌株的α-淀粉酶的胞外酶活較空白對照提高了73％，EGFP發(fā)酵液上清的熒光強度較空白對照提高8％，RPP0和SSO2共表達對于大分子蛋白質(zhì)α-淀粉酶

7、表現(xiàn)出更明顯的促進分泌效果。
　　最終，通過優(yōu)化啟動子、信號肽和過表達輔助蛋白，漆酶的胞外酶活從30.52±2.56U/L提高到585.21±1.28U/L，提高了18.17倍。
　　本課題的研究意義在于:運用基因?qū)用嫔系恼{(diào)控策略，不僅提高了大分子蛋白質(zhì)-漆酶在釀酒酵母中的分泌量，而且首次發(fā)現(xiàn)了輔助蛋白RPP0和SSO2在提高異源蛋白分泌水平上具有較強的協(xié)同作用和普遍適用性，對提高其他異源蛋白在釀酒酵母的分泌水平具有一定的指