顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域及牛乳鐵蛋白肽釀酒酵母分泌表達(dá)體系構(gòu)建.pdf

1、牛乳鐵蛋白肽(Bovine Lactoferricin，LfcinB)是牛乳鐵蛋白經(jīng)胃蛋白酶作用后從N-末端釋放的結(jié)構(gòu)域，含25個(gè)氨基酸殘基，具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用。由于其天然來源有限，人工化學(xué)合成價(jià)格昂貴如何通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)LfcinB，以滿足研究和應(yīng)用的需要，成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)釀酒酵母密碼子偏好設(shè)計(jì)LfcinB基因片段，人工合成LfcinB基因并構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-α-LfcinB，轉(zhuǎn)化

2、到大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增。提取純化重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化到釀酒酵母宿主菌INVSc1中，通過尿嘧啶缺陷篩選培養(yǎng)基篩選被轉(zhuǎn)化的酵母菌，接種于尿嘧啶缺陷選擇培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，添加半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。通過抑菌試驗(yàn)研究LfcinB的性質(zhì)，并根據(jù)抗生素微生物效價(jià)測定法中的管碟法一劑量法測LfcinB的微生物效價(jià)，結(jié)果表明:重組表達(dá)質(zhì)粒pYES2-α-LfcinB經(jīng)雙酶切和測序證明構(gòu)建正確，收集濃縮誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳

3、檢測，證實(shí)目的蛋白的存在。抑茵活性試驗(yàn)表明，重組LfcinB對大腸桿菌和枯草桿菌都有明顯的抑菌活性，對LfcinB的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果表明，在誘導(dǎo)溫度為26℃、誘導(dǎo)劑半乳糖濃度為3％的條件下誘導(dǎo)96h時(shí)表達(dá)產(chǎn)量最高，對LfcinB的性質(zhì)研究表明其具有熱穩(wěn)定性且LfcinB中二硫鍵的存在對其抑菌活性沒有影響，本實(shí)驗(yàn)成功在釀酒酵母中分泌表達(dá)了具有活性的LfcinB，為進(jìn)一步研究LfcinB的生物功能及應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　G13

4、結(jié)構(gòu)域是Granulysin中，含19個(gè)氨基酸殘基以及α-螺旋結(jié)構(gòu)、loop結(jié)構(gòu)，抗菌肽G13具有較多的正電荷與穩(wěn)定的兩性α-螺旋有助于提高殺菌活性，具有重要的研究價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)對顆粒裂解肽G13在釀酒酵母中的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對G13的性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，用部分甘油代替棉子糖對宿主菌的生長及對G13的表達(dá)沒有影響，顆粒裂解肽G13具有熱穩(wěn)定性，G13耐酸不耐堿。
　　牛乳鐵蛋白肽LfcinB和顆粒裂解肽G13的分子量都比

5、較小，表達(dá)產(chǎn)量都不高，本研究通過構(gòu)建重組pYES2-α-LG質(zhì)粒，之后電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1感受態(tài)細(xì)胞，通過半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)獲得大量的雜合抗菌肽LfcinB-G13。抑菌活性表明其對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌都有明顯的抑菌活性，其抑菌活性比相同表達(dá)體系表達(dá)的LfcinB和G1的抑菌活性都要高，表達(dá)產(chǎn)量也有所提高，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　當(dāng)利用質(zhì)粒載體大量而高效的表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，質(zhì)粒載體丟失即意味著產(chǎn)量的下降，進(jìn)而給生產(chǎn)帶來非常嚴(yán)重