釀酒酵母Ssz1蛋白新功能的研究.pdf

1、目的：過表達SSZ1能夠抑制酵母（scj1-1Δire1）的溫度敏感生長表型和恢復酵母（Δscj1Δire1）的生長致死效應。說明在過表達的情況下，SSZ1可能行使了不同于以往報道的細胞功能。利用過表達SSZ1給酵母帶來的基因表達譜變化，預測過表達SSZ1行使的細胞功能，并通過實驗進一步確證。另外，還探究了SSZ1結構域變化對其行使細胞新功能的影響。本項研究可加深對SCJ1基因功能和UPR機制的理解。
　　方法：使用Primer

2、premier5.0軟件設計SSZ1結構域缺失突變體引物，選取帶TDH3強啟動子的穿梭載體，經PCR擴增，純化，酶切和連接，構建SSZ1結構域缺失突變體載體，并測序鑒定；將構建的載體分別轉入野生型（W303）和溫度敏感型（scj1-1Δire1）酵母，利用連續(xù)稀釋培養(yǎng)法檢測過表達SSZ1突變體基因對野生型酵母抗藥性的影響和對溫度敏感型酵母溫度敏感效應的影響；將構建的載體轉入顏色分離酵母，利用劃線培養(yǎng)法觀察酵母生長的顏色，驗證過表達SSZ

3、1突變體基因是否具有完整的SSZ1細胞新功能。利用在線軟件SWISS-MODEL預測SSZ1結構域缺失突變體的蛋白結構，分析可能存在的細胞新功能的核心結構域。應用DNA microarray技術，獲得過表達SSZ1給酵母帶來的基因表達譜變化，通過差異表達基因的聚類分析，GO富集分析和PPI網絡分析，預測SSZ1基因可能的細胞功能，并通過生化實驗驗證其細胞功能。采用基因克隆，對篩選到的差異基因進行載體構建，通過連續(xù)稀釋培養(yǎng)法驗證差異表達基

4、因的細胞功能。最后，我們還對差異表達基因中涉及PDR通路，UPR通路，CWI通路的相關基因表達量進行了分析，從表達水平上確認過表達SSZ1與這三種通路的關系。
　　結果：（1）成功構建7個SSZ1缺失突變表達載體；（2）SSZ1突變體SSZ1Δ2-40，Δ2-115，Δ2-200，Δ2-240，Δ2-303，Δ2-372，Δ2-402轉入野生型酵母中，不具有抗藥性；（3）SSZ1突變體SSZ1Δ2-200，Δ2-240，Δ2-37

5、2，Δ2-402有抑制溫度敏感型酵母生長表型的功能，相反的，SSZ1突變體SSZ1Δ2-40，Δ2-115，Δ2-303，不具有抑制功能；（4）顏色分離酵母實驗顯示，SSZ1Δ2-200，Δ2-240，Δ2-372，Δ2-402有紅白相間的菌落出現，表明它們可能具有與完整SSZ1相同的細胞新功能。SSZ1Δ2-40，Δ2-115，Δ2-303則沒有紅白相間的菌落出現；（5）轉錄表達譜分析結果顯示過表達SSZ1能誘導升高多向耐藥性通路（P

6、DR）的相關基因，不誘導升高未折疊蛋白反應（UPR）的靶基因，過表達SSZ1還能夠上調細胞壁完整性信號通路（CWI）相關基因和轉錄因子RSC30的表達；（6）完成多個差異表達基因的克隆并驗證其細胞功能。PDR1，PDR5，RHO1，SMP1，KDX1不具有抑制酵母（scj1-1Δire1）溫度敏感表型的功能。1M滲透壓穩(wěn)定劑山梨醇能夠抑制（scj1-1Δire1）酵母溫度敏感表型而且RSC30有抑制酵母（scj1-1Δire1）溫度敏感

7、表型的功能。
　　結論：過表達SSZ1具有維持酵母細胞穩(wěn)健性（Cellular robustness）的新功能。Ssz1p結構域與其新功能有密切關系，Ssz1p的403-538位氨基酸是其新功能所必需的，另外，存在2個促進和2個抑制新功能發(fā)揮作用的結構域，它們分別是：2-40，241-303和116-200，304-372；SSZ1新功能不通過PDR通路和UPR通路，而是通過提高細胞壁的完整性，但是結果顯示過表達SSZ1的新功能不