MiR-143靶向PD-L1在電離輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著核能在軍事武器裝備領(lǐng)域、工業(yè)領(lǐng)域、醫(yī)療領(lǐng)域以及科學(xué)研究等領(lǐng)域的應(yīng)用不斷普及和擴(kuò)大，核能就像一把雙刃劍，一方面能夠極大造福我們?nèi)祟?，而另一方面則給我們帶來(lái)了日益嚴(yán)重的電離輻射危害。而作為電離輻射最重要的遠(yuǎn)后效應(yīng)之一，輻射致癌的發(fā)生率隨著民眾接觸到電離輻射的機(jī)會(huì)越來(lái)越多而不斷增加，已經(jīng)受到了輻射相關(guān)從業(yè)人員以及普通民眾的廣泛關(guān)注。除了輻射致癌能直接對(duì)人員健康造成巨大的傷害，還由于輻射致癌的潛伏期長(zhǎng)以及電離輻射看不見摸不著的特點(diǎn)會(huì)對(duì)民眾造

2、成巨大的心理恐慌，因此輻射致癌已經(jīng)引起研究人員廣泛的關(guān)注并開展了多方面的研究。
　　MicroRNA(縮寫為miRNA)又稱小分子RNA或者微小RNA，是真核生物內(nèi)的一類內(nèi)源性的單鏈RNA，一般由21～25個(gè)核苷酸構(gòu)成。首先由DNA轉(zhuǎn)錄形成長(zhǎng)度300-1000個(gè)堿基的pri-miRNA(primary transcript)，經(jīng)過一次加工后成為長(zhǎng)度70-90個(gè)堿基的miRNA前體pre-miRNA，再經(jīng)過Dicer酶切成為長(zhǎng)度21

3、-25個(gè)堿基的成熟miRNA。作為非編碼RNA，miRNA不是像別的mRNA那樣通過中心法則中的翻譯過程合成蛋白質(zhì)來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能，而是與靶基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA3'端非編碼區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)相互結(jié)合，從而抑制靶基因翻譯成蛋白起到沉默靶基因表達(dá)的作用。自1993年最先在線蟲中發(fā)現(xiàn)了miRNA，隨后在病毒、植物以及動(dòng)物等上面發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的miRNA，而每個(gè)miRNA又可以作用于幾十甚至上百個(gè)靶基因，因此，miRNA雖小，但它調(diào)控的范圍

4、非常廣，在正常的基因表達(dá)過程中發(fā)揮了極其重要的調(diào)節(jié)作用。MiRNA的高度保守性決定了miRNA在調(diào)控生物體最基本最重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育、免疫、腫瘤發(fā)生等一系列極為重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮了不可或缺的調(diào)節(jié)作用。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥中許多miRNA分別出現(xiàn)了明顯的高表達(dá)或者低表達(dá)，這其中約有一半得到注解的miRNA基因組定位于和腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，這說(shuō)明miRNA與腫瘤

5、的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。根據(jù)miRNA對(duì)腫瘤的調(diào)控作用，按功能可將miRNA分為癌基因樣miRNA(OncomiR)，如miR-21，以及抑癌樣基因(Anti-oncomiR)，如let-7。其中癌基因樣miRNA的高表達(dá)或者抑癌基因樣miRNA的低表達(dá)都會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，反過來(lái)，癌基因樣miRNA的低表達(dá)或者抑癌基因樣miRNA的高表達(dá)則會(huì)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　本教研室的課題組近年來(lái)一直從事輻射致癌方面的研究，已經(jīng)

6、通過多次分開低劑量照射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤成功建立了小鼠的輻射致癌模型，并對(duì)輻射致癌過程中與正常組織相比表達(dá)差異比較大的蛋白、基因和miRNA進(jìn)行了初步的研究。篩選出了一些表達(dá)差異比較明顯的miRNA進(jìn)行輻射致癌相關(guān)的后續(xù)研究，miR-143就是其中之一。MiR-143最早于2002年由Lagos-Quintana等從小鼠身上首次發(fā)現(xiàn)，人的miR-143位于5號(hào)染色體上33號(hào)位點(diǎn)。miR-143表達(dá)高度保守，已知的miR-143的靶基因有Kl

7、f4、Elk1、ADD3等，miR-143主要與心臟發(fā)育和癌癥相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)miR-143屬于抑癌基因樣miRNA，它在胰腺癌、白血病、淋巴癌、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌等細(xì)胞系中均表達(dá)明顯下調(diào)。
　　目前對(duì)輻射致癌的分子機(jī)制研究還多停留在單個(gè)信號(hào)通路上，還不夠系統(tǒng)，離徹底揭示輻射致癌分子機(jī)制還有很長(zhǎng)的路要走。對(duì)于miRNA在輻射致癌中的作用以及如何利用miRNA用于腫瘤的防治方面的研究還有待進(jìn)一步的擴(kuò)展和深入。本課題組通過miRNA芯

8、片結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143作用的靶蛋白很可能是PD-L1。
　　PD-L1（Programmed cell death ligand1）是程序性細(xì)胞死亡受體1(Programmedcell death1，PD-1)的配體之一，亦稱CD274(Cluster of differentiation274)或者B7-H1(B7 homolog1)。1999年中國(guó)科學(xué)家陳列平率先發(fā)現(xiàn)了PD-L1，隨后Dong

9、等首次采用cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽克隆出入B7-H1分子，而Freeman等發(fā)現(xiàn)它能夠直接結(jié)合PD-1，然后發(fā)揮抑制T細(xì)胞活化的功能，遂將它稱為PD-L1。作為B7免疫球蛋白超家族的第三個(gè)成員，它是一個(gè)分子量在40kD左右由290個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，與B7-DC(PD-L2，PD-1的另一個(gè)配體)、B7-1、B7-2以及ICOS的氨基酸同源性分別為40％、21％、20％和23％。人類的PD-L1基因位于9號(hào)染色體，而小鼠的則位于1

10、9號(hào)染色體，但它們相同的結(jié)構(gòu)是都由短而帶電的胞漿區(qū)、疏水結(jié)構(gòu)的跨膜區(qū)以及包含一個(gè)免疫球蛋白Ⅴ和一個(gè)免疫球蛋白C結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)三部分構(gòu)成。PD-L1的mRNA主要以4.2kb的形式存在，但也同時(shí)還以1.8kb、3.7kb以及7.2kb的不同轉(zhuǎn)錄形式存在。PD-L1廣泛表達(dá)于正常組織中的APC、T/B淋巴細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞、多種間質(zhì)細(xì)胞等淋巴組織相關(guān)細(xì)胞，它主要通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞的活性來(lái)抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)性。PD-L1還在大多數(shù)的腫瘤組

11、織中表達(dá)，而且是高表達(dá)，但在腫瘤旁邊的正常組織中卻是低表達(dá)，這提示我們它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　基于PD-L1通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)性在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而miRNA與多種癌癥相關(guān)，并且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，本文將miRNA與免疫負(fù)性共刺激分子PD-L1相結(jié)合，從利用miRNA調(diào)控PD-L1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的角度來(lái)闡明PD-L1在輻射致癌中的作用，并初步探索通過調(diào)控PD-L1來(lái)防治輻射

12、致癌的作用及其作用機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1.MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用:①觀察正常小鼠胸腺組織與輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤組織中miR-143的表達(dá)差異;②分別觀察上調(diào)、下調(diào)miR-143對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響;③觀察EL4細(xì)胞中上調(diào)miR-143表達(dá)對(duì)細(xì)胞裸鼠荷瘤成功率及腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　2.MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用機(jī)制:①預(yù)測(cè)miR-143以3，UTR依賴的方式靶向作用PD-L1影響輻射

13、誘導(dǎo)胸腺瘤的發(fā)生發(fā)展;②通過Rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PD-L1確實(shí)是miR-143的靶蛋白。
　　3.電離輻射對(duì)PD-L1表達(dá)的影響以及輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143與PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系:①觀察同一劑量照后不同時(shí)間以及不同劑量照后同一時(shí)間小鼠胸腺組織PD-L1表達(dá)變化;②觀察正常小鼠胸腺組織和輻射誘導(dǎo)胸腺瘤小鼠胸腺組織中PD-L1表達(dá)的差異;③觀察輻射誘導(dǎo)胸腺瘤小鼠胸腺組織中miR-143與PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系。

14、>　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.γ射線照射條件:采用實(shí)驗(yàn)用鈷-60γ射線進(jìn)行照射，劑量率為每分鐘0.58Gy。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng):小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基加入10％胎牛血清以及每毫升培養(yǎng)基各加入100單位的青霉素和鏈霉素;小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞培養(yǎng)條件為RMPI-1640培養(yǎng)基加入10％胎牛血清以及每毫升培養(yǎng)基各加入100單位的青霉素和鏈霉素，于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PC

15、R測(cè)定:采用SYBRGreenⅠ法，利用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過產(chǎn)物溶解曲線來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量。
　　4.細(xì)胞活力檢測(cè):MTT法檢測(cè)細(xì)胞的光密度值來(lái)確定細(xì)胞的增殖與活性。
　　5.細(xì)胞凋亡檢測(cè):采用AnnexinⅤ/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒通過流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率。
　　6.蛋白表達(dá)檢測(cè):通過與特異性抗體結(jié)合利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度或者抗體標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞比率來(lái)確定蛋白相對(duì)表達(dá)量。
　　7.RNA轉(zhuǎn)染

16、:根據(jù)lip02000轉(zhuǎn)染試劑盒操作提示將目的miRNA以及無(wú)意義miRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
　　8.腺病毒感染:將pre-miR-143前體通過腺病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞以上調(diào)miR-143表達(dá)。
　　9.MiRNA芯片:委托上海博奧生物集團(tuán)有限公司完成。
　　10.雙熒光報(bào)告基因檢測(cè):利用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-143對(duì) PD-L1的3'UTR報(bào)告基因活性影響。
　　11.裸鼠荷瘤:EL4細(xì)胞消化收集后配成10

17、7個(gè)/ml的濃度，將0.2ml細(xì)胞懸液注射到裸鼠頸背部皮下。
　　12.統(tǒng)計(jì)方法:兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間采用t檢驗(yàn)，多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間采用方差分析，p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中發(fā)揮抑制作用
　　1.1通過miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常胸腺組織;在對(duì)15對(duì)輻射誘導(dǎo)胸腺瘤與正常胸腺組織樣本通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中，也同樣

18、發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤中miR-143的表達(dá)明顯低于正常小鼠胸腺組織。
　　1.2通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-143表達(dá)可以顯著抑制NIH3T3以及EL4細(xì)胞的增殖，而且miR-143表達(dá)上調(diào)的越厲害對(duì)EL4細(xì)胞增殖的抑制作用就越強(qiáng)烈。
　　1.3無(wú)論是NIH3T3細(xì)胞還是EL4細(xì)胞，通過miR-143的反義抑制劑(miR-143ASO)下調(diào)miR-143后，通過MTT法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-143的表達(dá)能夠顯

19、著降低細(xì)胞的增殖活性。
　　1.4在EL4細(xì)胞中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-143表達(dá)可以增加細(xì)胞的凋亡，且細(xì)胞凋亡水平隨著miR-143表達(dá)的上調(diào)程度越大而增加越多;通過miR-143ASO下調(diào)NIH3T3細(xì)胞中miR-143表達(dá)可以顯著抑制其凋亡。
　　1.5將采用腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-143表達(dá)的EL4細(xì)胞和普通EL4細(xì)胞注射到裸鼠背頸部皮下，通過觀察30天內(nèi)裸鼠背頸部腫瘤生成率，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-143

20、的EL4細(xì)胞在荷瘤小鼠的成瘤率顯著降低，并且腫瘤體積也明顯要小。
　　2.MiR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用于PD-L1抑制輻射誘導(dǎo)胸腺瘤的發(fā)生發(fā)展
　　2.1雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果提示:在PD-L1的3'UTR野生型組，上調(diào)miR-143的表達(dá)可以顯著抑制PD-L1的表達(dá);而在PD-L1的3'UTR突變體組，miR-143表達(dá)的上調(diào)與PD-L1的表達(dá)變化關(guān)系不明顯，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而通過抗體標(biāo)記后利用流式細(xì)胞儀檢

21、測(cè)平均熒光強(qiáng)度的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-143可以顯著降低PD-L1的表達(dá)水平。這說(shuō)明miR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用PD-L1。
　　2.2上調(diào)miR-143和PD-L1表達(dá)的EL4細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)僅上調(diào)miR-143表達(dá)的EL4細(xì)胞中由于miR-143上調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能夠提高細(xì)胞的增殖與活性，Rescue實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一方面證實(shí)了在電離輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中PD-L1確實(shí)是 miR-143的作用靶蛋白。
　　3

22、.電離輻射能夠誘導(dǎo)正常胸腺組織中PD-L1高表達(dá)且在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143與PD-L1表達(dá)負(fù)相關(guān)
　　3.1 BALB/c小鼠8Gy照后0h、12h、24h、48h以及空白對(duì)照組胸腺組織研磨成單細(xì)胞懸液，抗體標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1表達(dá)變化，照后0-24h，PD-L1表達(dá)迅速增加，PD-L1表達(dá)增加與時(shí)間延長(zhǎng)近似成線性正相關(guān)，24h之后，PD-L1表達(dá)不再升高達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期;BALB/c小鼠0Gy、2Gy、4Gy、6

23、Gy和8Gy組照后24h，PD-L1表達(dá)升高先快后慢，整體近似成線性增加。這說(shuō)明輻射能夠誘導(dǎo)正常小鼠胸腺組織PD-L1表達(dá)上調(diào)且具有一定的照后時(shí)間和照射劑量依賴性。
　　3.2輻射誘導(dǎo)胸腺瘤與正常胸腺組織研磨成單細(xì)胞懸液，抗體標(biāo)記后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度來(lái)確定PD-L1表達(dá)，輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤的PD-L1表達(dá)比正常小鼠胸腺組織的明顯要高。
　　3.3輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中PD-L1蛋白表達(dá)顯著升高而PD-L1的mRNA變化

24、不明顯，miR-143與PD-L1蛋白的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。并且PD-L1蛋白表達(dá)與PD-L1的mRNA表達(dá)的比值與miR-143的表達(dá)也成負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)討論:
　　隨著人類對(duì)核能的利用越來(lái)越廣泛，民眾受到輻射致癌的危險(xiǎn)也越來(lái)越高，但是迄今為止，對(duì)輻射致癌機(jī)理的研究還沒有一個(gè)明確的解釋，對(duì)輻射致癌的防治也尚無(wú)比較好的治療的途徑。
　　近年來(lái)隨著腫瘤免疫治療研究的興起，負(fù)性共刺激因子PD-L1因?yàn)橥ㄟ^調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平

25、衡影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展成為研究熱點(diǎn)，而大量miRNA基因組定位于和腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，這說(shuō)明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系極為密切。正是基于此，本課題期望從miR-143通過調(diào)節(jié)PD-L1進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫從而在輻射致癌中發(fā)揮作用來(lái)初步探討PD-L1在電離輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用及相關(guān)潛在的輻射致癌防治的可能途徑。
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)miR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中低表達(dá)，它對(duì)細(xì)胞能夠抑增殖和促凋亡，并且miR-143以3'UTR依賴的

26、方式靶向作用于PD-L1。在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中它還與PD-L1蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)，并且通過上調(diào)miR-143表達(dá)抑制PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而能夠降低細(xì)胞增殖與活性、提高細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮輻射致癌的防治作用。另一方面輻射能夠誘導(dǎo)機(jī)體PD-L1表達(dá)升高，在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤等一系列腫瘤中PD-L1也是高表達(dá)，而PD-L1在腫瘤的免疫逃逸機(jī)制做發(fā)揮重要作用，這也提示我們通過抑制PD-L1的表達(dá)可能能夠起到防治輻射致癌的作用?？偠灾ㄟ^電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞下