負(fù)性共刺激分子PD-L1在卵巢癌免疫逃逸中的作用及其機(jī)制.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生機(jī)制及病因?qū)W尚未明確。近年來，隨著腫瘤微環(huán)境在癌癥發(fā)生和發(fā)展認(rèn)識的加深，人們對于卵巢癌免疫逃逸機(jī)制的探討成為該領(lǐng)域前沿課題。作為腫瘤免疫效應(yīng)階段的執(zhí)行場所，腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在許多因素參與腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用，包括局部效應(yīng)細(xì)胞功能障礙、抑制性免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的負(fù)調(diào)節(jié)作用、抑制性配體受體反應(yīng)以及腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞代謝活性的負(fù)調(diào)節(jié)等。
　　研究顯示，作為重要的一組參與免疫逃逸的B7家

2、族負(fù)性共刺激分子在癌組織中表達(dá)是腫瘤微環(huán)境中極為重要的一個特征，其中，PD-L1是近年來備受關(guān)注的負(fù)性免疫分子，稱之為免疫卡控點(diǎn)（Immune Checkpoint），其通過抑制T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的分泌和促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫逃逸過程發(fā)揮著極為重要的作用。
　　本文以免疫卡控點(diǎn)分子PD-L1為靶分子，以腫瘤微環(huán)境為切入點(diǎn)，借助組織學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、動物學(xué)手段，探討該分子介導(dǎo)卵巢癌的免疫逃逸的

3、作用及機(jī)制。
　　論文第一部分采用免疫組織化學(xué)方法檢測了人卵巢癌組織中 PD-L1分子的表達(dá)（n=81），分析其和浸潤腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、CD8+T細(xì)胞、細(xì)胞增殖抗原 Ki-67的相關(guān)性。結(jié)果顯示：①卵巢癌組織 PD-L1分子的表達(dá)可分為胞膜為主型（9/81，11.11％），胞漿為主型（32/81，39.50％），胞膜胞漿混合型（13/81，16.05％），胞膜胞漿低/不表達(dá)型（27/81，33.33％）；②癌細(xì)胞不同部位

4、 PD-L1表達(dá)水平與FIGO分期和病理類型均無關(guān)（P>0.05），但低分化組癌細(xì)胞膜上PD-L1分子的表達(dá)高于中低分化組（P<0.05）；③在癌細(xì)胞胞漿PD-L1低/不表達(dá)組和中/高表達(dá)組CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤程度有差異（P<0.05），在癌細(xì)胞胞膜低/不表達(dá)組和中/高表達(dá)組中CD68+細(xì)胞浸潤程度有差異（P<0.05）。
　　論文第二部分探討了PD-L1分子在卵巢癌細(xì)胞上的表達(dá)及其意義。首先通過小分子干擾RNA（siRNA）干

5、擾卵巢癌細(xì)胞株中PD-L1分子的表達(dá)來觀察該分子在腫瘤增殖、侵襲中所發(fā)揮的作用，并進(jìn)一步驗(yàn)證卵巢癌細(xì)胞 PD-L1分子介導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而在卵巢癌模型中評價干預(yù) PD-L1信號的免疫治療價值。結(jié)果顯示：①干擾卵巢癌細(xì)胞中 PD-L1分子后腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，侵襲能力明顯下降；②在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)下卵巢癌細(xì)胞膜上上調(diào)表達(dá)的PD-L1分子能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的凋亡，采用PD-L1單抗能阻斷上述效應(yīng)；③建立小鼠卵巢癌ID8模型，

6、成瘤小鼠腫瘤組織和脾臟中CD8+T細(xì)胞均存在P D-1分子的表達(dá)，分別采用阻斷型PD-L1單抗和阻斷型PD-1單抗進(jìn)行免疫治療，和對照組相比，抗體治療組均能明顯控制腫瘤生長，且伴有脾臟中C D8+T細(xì)胞上P D-1分子的表達(dá)下調(diào)。
　　論文第三部分探討卵巢癌細(xì)胞上 PD-L1分子的表達(dá)及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果顯示：①體外培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞中存在PD-L1分子mRNA的表達(dá)，但其蛋白質(zhì)水平的表達(dá)不位于膜表面，而是在胞內(nèi)，體內(nèi)成瘤過

7、程能上調(diào) SKOV3細(xì)胞膜PD-L1分子的表達(dá)；②胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測結(jié)果表明，卵巢癌組織來源的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）可分泌IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?。免疫組化結(jié)果亦證實(shí)癌組織中IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?的表達(dá)水平均高于卵巢良性疾病組織；③進(jìn)而觀察了TAM及相關(guān)細(xì)胞因子對卵巢癌細(xì)胞表面P D-L1的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，采用TAM上清及相關(guān)因子IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?培養(yǎng)SKOV

8、3細(xì)胞96 h后，SKOV3細(xì)胞膜表面PD-L1分子的表達(dá)明顯上調(diào)。Western blot和real-time PCR分析顯示，不同細(xì)胞因子刺激下 SKOV3細(xì)胞 PD-L1分子表達(dá)的增加在于總蛋白表達(dá)水平增加，而并非在于轉(zhuǎn)錄水平的改變；④Western blot分析顯示，TNF-α、IFN-γ刺激SKOV3細(xì)胞15 min后ERK1/2的磷酸化、AKT的磷酸化明顯增加，不伴有STAT3磷酸化的增加；IL-6、IL-10刺激SKOV3

9、細(xì)胞不能促進(jìn)ERK1/2的磷酸化和AKT的磷酸化，但I(xiàn)L-6可上調(diào)STAT3的磷酸化。⑤采用化學(xué)阻滯劑封閉AKT信號后，IFN-γ介導(dǎo)SKOV3細(xì)胞膜表面表達(dá)PD-L1分子效應(yīng)部分阻斷。采用化學(xué)阻滯劑封閉ERK信號后，TNF-α介導(dǎo)SKOV3細(xì)胞膜表面表達(dá)PD-L1分子效應(yīng)部分阻斷；封閉AKT信號和ERK信號不影響IL-10、IL-6上調(diào)SKOV3細(xì)胞膜上PD-L1分子表達(dá)的效應(yīng)；STAT3抑制劑 AG490也不影響 IL-6、IL-1

10、0上調(diào)SKOV3細(xì)胞膜上PD-L1分子表達(dá)的作用。
　　論文第四部分將在卵巢癌中分析一群以表達(dá) PD-L1分子為特征的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，探討其生物學(xué)特征和臨床檢測意義。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①卵巢癌組織浸潤巨噬細(xì)胞較卵巢囊腫浸潤巨噬細(xì)胞更高水平表達(dá) PD-L1分子。在卵巢癌患者外周血，存在一群以表達(dá)PD-L1分子為特征的巨噬細(xì)胞，III-IV期卵巢癌患者外周血中這群細(xì)胞的含量高于I-II期患者（P<0.05）；②進(jìn)一步的分析顯示，和PD-

11、L1分子表達(dá)陰性的巨噬細(xì)胞相比，P D-L1分子表達(dá)陽性的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌有不同的特點(diǎn)，提示這可能構(gòu)成一群獨(dú)立的巨噬細(xì)胞亞群，在卵巢癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞亞群。
　　綜上，卵巢癌以不同程度和方式表達(dá)PD-L1分子，胞膜上出現(xiàn)PD-L1分子的表達(dá)也伴隨著癌細(xì)胞惡性程度的增加，PD-L1分子的表達(dá)也和浸潤腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、核增殖抗原存在相關(guān)；腫瘤微環(huán)境能介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞膜上PD-L1分子表達(dá)的上調(diào)，而不影響

12、胞漿中PD-L1分子的表達(dá)，也不影響其mRNA水平，其中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的多種細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用，涉及到了AK T、ERK1/2信號；卵巢癌細(xì)胞胞漿中PD-L1分子的表達(dá)具有功能性，可維系腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，膜表面PD-L1分子的表達(dá)則發(fā)揮抑T細(xì)胞活性的作用；采用PD-L1、PD-1單抗均可在卵巢癌荷瘤模型中發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，PD-L1分子還可通過腫瘤相關(guān)細(xì)胞進(jìn)一步介導(dǎo)免疫逃逸，以表達(dá) PD-L1分子為特征的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)