纖絲狀Aβ1-42與Aβ1-42寡聚體誘導阿爾茨海默氏病模型大鼠行為學、海馬超微結構變化、炎癥因子表達及海風藤的干預研究.pdf

1、研究背景:阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的變性疾病，其典型的臨床表現(xiàn)為進行性加重的記憶力減退、認知功能障礙、行為異常和社交障礙。主要的病理改變?yōu)樯窠?jīng)纖維纏結(neurofibrillarytangle，NFT)、老年斑形成(senileplaque，SP)和神經(jīng)元缺失。AD的發(fā)病機制復雜，病因至今不清，自20世紀80年代以來形成了各種假說，目前普遍公認的是β淀粉樣蛋白(β-amyloid p

2、rotein，Aβ)假說，Aβ是SP的主要組成成分，由β淀粉樣蛋白前體蛋白(Aβprecursor protein，APP)通過β、γ分泌酶水解產(chǎn)生。AD的發(fā)生、發(fā)展與Aβ因代謝障礙而在基底前腦異常沉積密切相關。而且近年來的研究發(fā)現(xiàn)，與纖絲狀Aβ相比較Aβ寡聚體具有更高的神經(jīng)毒性，是AD發(fā)病過程中的主要毒性物質[1]。只是目前Aβ寡聚體的整體動物行為學實驗結果還存在爭議[2]，不同聚集形式Aβ之間整體動物水平上的對比研究也較少。

3、　　 目前關于AD發(fā)病過程的研究提示，Aβ激活膠質細胞誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥損傷可能是導致AD的一個核心病理環(huán)節(jié)[3，4,5],參與該炎性反應的主要是小膠質細胞(microglia，Mi)，位于Mi表面的Toll樣受體(Toll—like receptors，TLRs)及其輔助受體CD14共同參與了Aβ激活Mi的過程[6,7]，但是上述結論多來自纖絲狀Aβ的研究，TLRs能否識別寡聚體的Aβ還沒有定論[8]。
　　 此外，A

4、D的基礎研究過程中，動物模型的建立一直是關鍵，但是目前各類模型都存不足，還沒有任何一種動物模型能全面再現(xiàn)、模擬AD的病理、生化、行為學等方面的全部特征。本實驗使用微滲泵將Aβ1-42聚合體和寡聚體持續(xù)灌注至大鼠側腦室建立AD模型，從而使大量Aβ緩慢持續(xù)彌散性地分布到老齡大鼠腦內，較好地解決了同類模型Aβ短時在注射點局部聚集的問題，與AD的臨床病理過程更接近。
　　 中藥海風藤是胡椒科胡椒屬植物風藤的藤莖，中國藥典記載其具有通經(jīng)絡

5、、祛風濕和止痹痛的功效，現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和神經(jīng)保護作用，近年來開始應用于AD的治療研究[9,10]。
　　 本研究應用纖絲狀Aββ1-42和Aβ1-42寡聚體側腦室持續(xù)灌注制備AD大鼠模型，觀察兩種不同聚集形式的Aβ對大鼠行為學、海馬區(qū)神經(jīng)細胞超微結構及Toll樣受體4(Toll—like receptor4，TLR4)等炎癥因子表達的影響，同時應用海風藤提取物干預治療，觀察其對上述指標的作用，以期進一步揭示AD的發(fā)病

6、機制、探尋安全有效的治療方法。
　　 目的:探討纖絲狀Aβ1-42與Aβ1-42寡聚體對大鼠行為學、海馬區(qū)神經(jīng)細胞超微結構及TLR4、核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)表達的影響;探討應用海風藤干預后上述指標的變化。
　　 方法:健康雄性SD大鼠60只，隨機數(shù)字表法平均分為10組:正常對照組(Control

7、組)、假手術組（Sham組）、纖絲狀Aβ+載體1組（FAβ組，腦室內灌注纖絲狀Aβ+乙腈和三氟乙酸造模）、纖絲狀Aβ+海風藤提取物(Piper kadsura ohwi PKO)組（FAβ+PKO組，腦室內灌注纖絲狀Aβ+乙腈和三氟乙酸造模，腹腔注射PKO治療）、纖絲狀Aβ+二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide DMSO)組(FAβ+DMSO組，腦室內灌注纖絲狀Aβ+乙腈和三氟乙酸，腹腔注射DMSO)、載體1組(Veh1組，

8、腦室內不注射Aβ，僅灌注乙腈和三氟乙酸)、Aβ寡聚體+載體2組（AβO組，腦室內灌注Aβ寡聚體+高密度脂蛋白和羥乙基哌嗪乙磺酸造模）、Aβ寡聚體+PKO(AβO+PKO組，高密度脂蛋白和羥乙基哌嗪乙磺酸造模，腹腔注射PKO治療)、Aβ寡聚體+DMSO組(AβO+DMSO組，腦室內灌注Aβ寡聚體+高密度脂蛋白和羥乙基哌嗪乙磺酸，腹腔注射DMSO)、載體2組(Veh2組，腦室內不注射Aβ，僅灌注高密度脂蛋白和羥乙基哌嗪乙磺酸)。采用微滲泵向

9、側腦室持續(xù)灌注纖絲狀Aβ1-42或Aβ1-42寡聚體法制作動物模型。造模后每天給予FAβ+PKO組和AβO+PKO組大鼠腹腔注射濃度10％含2.5％DMSO的PKO，按體重給藥(1ml/100g)，F(xiàn)Aβ+DMSO組和AβO+DMSO組大鼠每天僅給予2.5％DMSO腹腔注射(1ml/100g)，連續(xù)給藥35天。造模后第31天開始進行Morris水迷宮實驗評定大鼠的學習記憶功能，實驗分為空間探索和定向航行兩部分。空間探索實驗時記錄大鼠的逃

10、避潛伏期，定向航行實驗時錄制大鼠在水迷宮游動視頻，計算其穿越平臺次數(shù)，在平臺所在象限穿行的時間比率和路程比率。電鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞超微結構，實時熒光定量聚合酶鏈式擴增反應(real-time polymerasechainreactio，RT-PCR)法檢測海馬區(qū)TLR4mRNA表達，免疫印跡法(Western blot，WB)檢測NF-κBP65、TLR4蛋白表達，酶標記免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α的表達。
　　

11、結果:
　　 (1)水迷宮實驗結果:
　　 Control組、Sham組、Veh1組和Veh2組之間比較逃避潛伏期、穿越平臺的次數(shù)、時間比率和路程比率無顯著性差異（P均＞0.05）;FAβ組與FAβ+DMSO組比較、AβO組與AβO+DMSO組比較逃避潛伏期、穿越平臺的次數(shù)、時間比率和路程比率無顯著性差異(P均＞0.05);FAβ組、FAβ+DMSO組和AβO組、AβO+DMSO組與Control組、Sham組、Veh1

12、組和Veh2組比較逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺的次數(shù)顯著減少、時間比率和路程比率也顯著減低(P均＜0.05);AβO組與FAβ組比較逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺的次數(shù)顯著減少、時間比率和路程比率也顯著減低（P均＜0.05）;FAβ+PKO組和AβO+PKO組與Control組、Sham組、Veh1組和Veh2組比較逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺的次數(shù)顯著減少、時間比率和路程比率也顯著減低（P均＜0.05）;但與FAβ組、FAβ+DMSO組

13、和AβO組、AβO+DMSO組比較逃避潛伏期顯著縮短、穿越平臺的次數(shù)顯著增加、時間比率和路程比率也顯著增高（P均＜0.05）。
　　 (2)電鏡下海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞超微結構觀察:
　　 Control組、Sham組、Veh1組和Veh2組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞超微結構未見明顯異常;AβO組和AβO+DMSO組與FAβ組和FAβ+DMSO組均見到神經(jīng)細胞大量凋亡和不同程度的損傷，以AβO組損傷最嚴重;FAβ+PKO組和Aβ

14、O+PKO組均可見少量凋亡神經(jīng)細胞，神經(jīng)細胞損傷程度AβO組和AβO+DMSO組與FAβ組和FAβ+DMSO組較輕。
　　 (3)電鏡半薄切片光鏡下海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)細胞觀察:
　　 Control組、Sham組、Veh1組和Veh2組大鼠海馬CA1區(qū)均可見極少量凋亡神經(jīng)元，但凋亡神經(jīng)元數(shù)量組間比較無顯著性差異（P均＞0.05）;FAβ組、FAβ+DMSO組、AβO組和AβO+DMSO組大鼠海馬CA1區(qū)均見大量凋亡神經(jīng)

15、元，且凋亡神經(jīng)元數(shù)量較Control組、Sham組、Veh1組和Veh2組顯著增多（P均＜0.05），但FAβ組與FAβ+DMSO組比較、AβO組與AβO+DMSO組比較凋亡神經(jīng)元數(shù)量無顯著性差異(P均＞0.05);AβO組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量較FAβ組明顯增多(P＜0.05);FAβ+PKO組和AβO+PKO組凋亡神經(jīng)元數(shù)量較Control組、Sham組、Veh1組、Veh2組增多（P均＜0.05），但與FAβ組、FAβ+D

16、MSO組、AβO組和AβO+DMSO組比較明顯減少（P均＜0.05）。
　　 (4)RT-PCR、WB、ELISA結果:
　　 Control組、Sham組、Veh1組和Veh2組之間比較TLR4、NF-κB、TNF-α表達無顯著性差異(P均＞0.05);FAβ組與FAβ+DMSO組比較、AβO組與AβO+DMS0組比較TLR4、NF-κB、TNF-α表達無顯著性差異(P均＞0.05);FAβ組、FAβ+DMSO組、Aβ

17、O組和AβO+DMSO組與Control組、Sham組、Veh1組和Veh2組相比TLR4、NF-κB、TNF-α表達均顯著增強（P均＜0.05）;AβO組TLR4、NF-κB、TNF-α表達較FAβ組增強(P＜0.05);FAβ+PKO組和AβO+PKO組TLR4、NF-κB、TNF-α表達較Control組、Sham組、Veh1組、Veh2組增多（P均＜0.05），但與FAβ組、FAβ+DMSO組、AβO組和AβO+DMSO組比較T

18、LR4、NF-κB、TNF-α表達明顯減少（P均＜0.05）。
　　 (5)偏相關分析結果:
　　 TLR4、NF-κB、TNF-α與穿越平臺次數(shù)都呈現(xiàn)負相關（P均=0.000），TLR4、NF-κB、TNF-α之間均為正相關(P均=0.000)。
　　 結論:
　　 (1)向一側側腦室持續(xù)灌注Aβ1-42能成功建立AD動物模型;
　　 (2)纖絲狀Aβ1-42和Aβ1-42寡聚體均可誘導神經(jīng)細胞