mtDNA誘導(dǎo)的PD-L1-PD-1信號(hào)分子對(duì)T細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　1、觀察mtDNA對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響；
　　2、以UO126(MEK1/2通路抑制劑)，SB203580(p38通路抑制劑)，SN50(NF-kB通路抑制劑)，LY294002(PI3K通路抑制劑)干預(yù)上述信號(hào)通路,篩選明顯抑制PD-L1表達(dá)的細(xì)胞通路，并用氯喹（chloroquine, CQ）作用于經(jīng)mtDNA刺激的巨噬細(xì)胞觀察p38信號(hào)通路的變化,探討巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通

2、路；
　　3、研究mtDNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞免疫活性的影響，并通過抗PD-L1單克隆抗體阻斷PD-L1/PD-1信號(hào)分子改善其對(duì)T細(xì)胞功能的抑制。
　　方法：
　　采用體外實(shí)驗(yàn)研究。
　　1.根據(jù)mtDNA濃度，分為3組：空白對(duì)照組；1ug/ml mtDNA組；10ug/ml mtDNA。分別加入 PBS1ul;1ug/ml mtDNA和10ug/ml mtDNA，24小時(shí)提取各組，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1表

3、達(dá)。根據(jù)檢測(cè)時(shí)間不同分為6組，每組均加入10ug/ml mtDNA，分別在0小時(shí)、6小時(shí)、12,小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)提取各組，流式檢測(cè)PD-L1表達(dá)。
　　2.將巨噬細(xì)胞分為5組：10ug/ml mtDNA組；UO126組；SB203580組；SN50組；LY294002組。給予10ug/mlmtDNA；其余4組在給予10ug/ml mtDNA1小時(shí)前分別給予信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑：20uM UO126(MEK1/2),10

4、uMSB203580(p38MAPK),20uM SN50(NF-kB),25 uM LY294002(PI3K)，培養(yǎng)24小時(shí)后對(duì)各組檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1表達(dá)。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)所得結(jié)果，用Western blotting細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路檢測(cè):將巨噬細(xì)胞分為2組：10ug/ml mtDNA組；10ug/ml mtDNA+CQ組。給予mtDNA前30分鐘加氯喹10 ug/ml，分別在0min、15min、30min、60min

5、及120min提取各項(xiàng)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。
　　3.10ug/ml mtDNA予小鼠腹腔巨噬細(xì)胞孵育24小時(shí)與磁珠分選(MACS)法得到的小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)。按巨噬細(xì)胞與 CD4+T細(xì)胞1:10比例混合培養(yǎng)于96孔圓底板中，處理48小時(shí)后收集各組懸浮細(xì)胞，酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)每個(gè)孔中的吸光度值[OD(450)]；根據(jù)ELISA試劑中的說明，72小時(shí)后收集各組細(xì)胞上清液檢測(cè)IFN-γ的含量

6、。所有資料以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用 SPSS18.0軟件檢驗(yàn)，多組間的比較應(yīng)選用單因素方差分析（one-wayANOVA），P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度mtDNA對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PD-L1分子表達(dá)情況:24h時(shí)后對(duì)照組、1ug/ml mtDNA組與10ug/ml mtDNA組在巨噬細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)量隨濃度增加而增加；10ug/ml mtDNA組隨時(shí)間變化，表達(dá)量逐步升高，

7、在給藥6小時(shí)后開始迅速升高，于24小時(shí)~72小時(shí)維持高峰狀態(tài)，72小時(shí)后緩慢下降，但仍處于較高水平，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.SB203580組巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)明顯降低，mtDNA（10ug/mL）組細(xì)胞的P-P38、P38蛋白表達(dá)隨時(shí)間逐高，加用氯喹組mtDNA刺激的巨噬細(xì)胞P-P38蛋白表達(dá)沒有上調(diào)。表明mtDNA通過TLR9調(diào)節(jié)下游p38細(xì)胞信號(hào)通路。
　　3.CD4+MΦ+mtDNA組和 CD4+MΦ+mtDNA

8、+anti-PD-L1組MTT OD值顯著高于前兩組，而且CD4+MΦ+mtDNA+anti-PD-L1組的增殖作用最明顯，與CD4+MΦ+mtDNA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入a-PD-L1后，IFN-γ分泌水平明顯較CD4+MΦ+mtDNA組和CD4+MΦ+mtDNA+IgG1組高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.mtDNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1，并成時(shí)間賴、濃度依性;
　　2.mtDNA通過TLR