抗菌型人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的功能鑒定及其對膿毒癥小鼠的治療作用.pdf

1、目的:
　　膿毒癥是由于宿主對細(xì)菌等感染的反應(yīng)失調(diào)所導(dǎo)致的危及生命的嚴(yán)重器官功能障礙，病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重情況下可出現(xiàn)膿毒癥休克和多器官功能障礙，致死和致殘率高，是臨床中危重癥病人死亡的主要原因之一。目前臨床上對膿毒癥多以對癥及支持治療為主，尚無特效療法。
　　膿毒癥發(fā)病的病理生理機(jī)制復(fù)雜，是多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。在細(xì)菌和內(nèi)毒素等始動因素的作用下，機(jī)體大量釋放細(xì)胞因子和趨化因子等炎性介質(zhì)。各內(nèi)源性因子相互作用形成網(wǎng)絡(luò)效

2、應(yīng)，引起炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大，造成凝血、免疫、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)及器官的損傷及功能失調(diào)。既往一些針對膿毒癥病理過程中單一因素或單一環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控的努力均宣告失敗，提示膿毒癥的治療應(yīng)從控制感染、減少毒素、平衡炎癥、修復(fù)組織等方面綜合考量。
　　多項動物實驗顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過平衡炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)、改善器官功能、降低細(xì)菌負(fù)荷等途徑而提高膿毒癥模型動物的生存率，顯示了干細(xì)胞在膿毒癥治療方面的巨大潛力。殺菌/通透性增加蛋白(BPI)是

3、一類帶有正電荷的抗菌肽，可以競爭性拮抗LBP，與革蘭陰性菌外膜上的LPS結(jié)合，增加細(xì)菌外膜通透性，造成菌體裂解死亡，也可以與游離的LPS結(jié)合而消除LPS的活性。LL-37具有廣譜的抗菌作用，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有較強(qiáng)殺菌能力。它既能夠與LPS結(jié)合，也可以與CD14分子結(jié)合，從而阻止LPS-CD14復(fù)合物的形成，阻斷LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　實驗室在前期研究中構(gòu)建了融合蛋白BPI-LL37/LL37-BPI，然后以慢

4、病毒為基因遞送載體，制備可以分泌該兩種融合蛋白的功能增強(qiáng)型人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(BPI-LL37-hUC-MSCs、LL37-BPI-hUC-MSCs，以下簡寫為BL-hUC-MSCs、LB-hUC-MSCs)。本篇研究將從體外功能鑒定和在體動物實驗兩方面證實該功能增強(qiáng)型人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的功能。
　　方法:
　　采用流式細(xì)胞儀術(shù)檢測兩種干細(xì)胞BL-hUC-MSCs、LB-hUC-MSCs的表面CD29、CD34、CD44、C

5、D45、CD90、CD105的表達(dá)情況，并將兩種干細(xì)胞向成骨、成軟骨、脂肪方向誘導(dǎo)分化，以鑒定其三系分化能力。收集兩種抗菌型干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，與LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA法檢測上清中的炎癥因子水平，然后通過抑菌實驗鑒定這兩種條件培養(yǎng)對多種細(xì)菌生長的抑制作用，并采用鱟試驗法檢測這兩種條件培養(yǎng)基對內(nèi)毒素的中和效果。
　　盲腸結(jié)扎穿孔法建立小鼠膿毒癥模型，根據(jù)術(shù)后聯(lián)用抗生素時間的不同，將該模型分為A、B兩個子模型，

6、A模型于術(shù)后6h聯(lián)用抗生素，B模型于術(shù)后24h聯(lián)用抗生素。兩個子模型均分為sham組、PBS治療組（PBS組）、hUC-MSCs治療組（WT組），BL-hUC-MSCs治療組(BL組)，術(shù)后3h，PBS組經(jīng)尾靜脈注射0.2mlPBS，WT組注射等體積的hUC-MSCs懸液(7.5×105mL-1)，BL組注射等體積的BL-hUC-MSCs懸液(7.5×105mL-1)。術(shù)后觀察各組小鼠一般狀況，繪制術(shù)后120h生存率曲線。術(shù)后48h收集

7、B模型各組小鼠的血清，生化檢驗評價肝、腎及胰腺功能，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平，HE染色評估小鼠肝、腎、肺組織病理變化，免疫組化染色檢查小鼠肝、腎、脾及肺組織cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.BL-hUC-MSCs與LB-hUC-MSCs表面標(biāo)記物中CD29、CD44、CD90的陽性率和CD34、CD45的陰性率均大于95％，C

8、D105陽性率降低，在部分細(xì)胞表達(dá)量減少;
　　2.BL-hUC-MSCs與LB-hUC-MSCs均可以向成骨、成軟骨和脂肪細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化;
　　3.BL-hUC-MSCs和LB-hUC-MSCs的條件培養(yǎng)基可以降低巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá);
　　4.BL-hUC-MSCs和LB-hUC-MSCs的條件培養(yǎng)基對多種細(xì)菌的生長產(chǎn)生抑制作用;
　　5.BL-hUC-MSCs和LB-hUC-MSCs的條件培養(yǎng)基對內(nèi)毒素

9、可以起到中和作用。
　　第二部分:
　　1.A模型中，hUC-MSCs對生存率的改善要優(yōu)于BL-hUC-MSCs;B模型中BL-hUC-MSCs對生存率的改善要優(yōu)于hUC-MSCs;
　　2.BL-hUC-MSCs移植可以降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平;
　　3.BL-hUC-MSCs移植可以降低血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶、肌酐和尿素等指標(biāo)的水平;
　

10、　4.BL-hUC-MSCs移植可以改善肝臟、腎臟和肺受損的組織結(jié)構(gòu);
　　5.BL-hUC-MSCs移植可以減少肝臟、腎臟、脾臟及肺cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.構(gòu)建的抗菌型干細(xì)胞BL-hUC-MSCs和LB-hUC-MSCs在體外均具有抗菌、抗炎及中和內(nèi)毒素功能，相對而言，BL-hUC-MSCs的作用更強(qiáng)。
　　2.移植BL-hUC-MSCs可以降低膿毒癥小鼠炎癥水平、保