抗菌型間充質(zhì)干細胞的構(gòu)建與功能鑒定.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，病情惡化快，死亡率高，是嚴重燒、創(chuàng)傷患者、腫瘤等危重病患者晚期死亡的主要原因。目前尚無針對膿毒癥的特效治療方法，當前的治療方案仍是抗感染和涉及幾乎所有系統(tǒng)的全身支持治療，研究進展也遲遲沒有突破。
　　值得欣慰的是，近年來研究發(fā)現(xiàn)干細胞不僅具有再生修復功能，還具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎的特性。干細胞移植對于脊髓損傷、心肌缺血性損傷、急性肺損傷、急性腦損傷和骨股頭壞死等組織損傷性疾病的治

2、療顯示了出好的療效。此外，干細胞移植治療膿毒癥方面也顯示出驚人在療效。干細胞一方面可通過旁分泌作用，分泌一些如TGF-β、IL-10、IL-13和TSG-6等抗炎細胞因子，進而調(diào)節(jié)機體的炎癥反應;另一方面，干細胞還可直接與樹突狀細胞、NK細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等免疫細胞相互作用，直接調(diào)控這些免疫細胞的功能，在抗炎和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。動物實驗顯示干細胞移植治療膿毒癥有明顯的療效，大大降低的死亡率，并有效控制機體的過度炎癥反應。

3、
　　殺菌/通透性增加蛋白（Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI）是一種從中性粒細胞初級顆粒中釋放的55kDa大小的抗菌肽，具有革蘭陰性細胞毒作用和LPS中和能力，是先天免疫系統(tǒng)的組成部分。rBPI21是由野生型BPI蛋白N'端的21 kDa的片段組成的重組蛋白，其較野生型蛋白具有更強、更穩(wěn)定的生物學功能。在基于動物實驗的研究中rBPI21被證實對肺炎、膿毒癥等感染性疾病

4、都有保護效應，更重要的是其在臨床試驗中也顯示了治療效果。
　　LL-37是Cathelicidin抗菌蛋白家族在人類身上的唯一成員，它可以被多種組織和細胞分泌，具有殺滅和抑制多種病原微生物生長的活性，不易耐藥，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)了LL-37具有免疫調(diào)節(jié)和促愈的作用。
　　本研究著眼于膿毒癥的疾病特點和研究現(xiàn)狀，提出“抗菌、抗內(nèi)毒素、抗

5、炎和組織器官保護綜合治療”的治療策略，并尋求和驗證可應用于該策略的治療藥物。
　　目的:
　　1.將rBPI21和與之類似的陽離子抗菌肽LL-37融合，以期獲得抗菌能力增強且具備免疫調(diào)節(jié)能力的抗菌融合蛋白。
　　2.應用構(gòu)建完成的BPI-LL37抗菌融合蛋白對間充質(zhì)干細胞進行基因修飾，提高間充質(zhì)干細胞的抗菌和毒素中和能力，以期獲得具有殺菌、中和內(nèi)毒素的抗菌型間充質(zhì)干細胞。
　　方法:
　　通過PCR方法從B

6、PI和LL-37基因的cDNA中擴增并突變獲得需要的rBPI21和LL37活性片斷，構(gòu)建rBPI21-LL37/LL37-rBPI21融合蛋白的表達載體，BPI蛋白質(zhì)和LL-37蛋白質(zhì)之間通過柔性片段(GGSGG)連接。之后將表達載體用瞬時轉(zhuǎn)染方法導入模式細胞A549中。后通過Western blot檢測A549細胞表達融合蛋白的情況，通過抑菌試驗驗證此融合蛋白的分泌與抗菌能力。
　　融合蛋白構(gòu)建成功后，將表達載體上的融合蛋白基因

7、克隆至慢病毒載體中，并將其包裝成為具有生物活性的慢病毒顆粒。再用慢病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細胞，以完成對其的基因修飾。之后通過流式細胞術(shù)鑒定感染后的間充質(zhì)干細胞的細胞表面標志，通過Western blot鑒定感染后的MSCs中融合蛋白的表達情況，通過抑菌試驗鑒定含有感染后的MSCs外分泌物質(zhì)的培養(yǎng)上清是否具有抗菌能力。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、DNA電泳和DNA測序證實融合蛋白表達載體（pLVX-BPI-LL-

8、37）構(gòu)建成功;Western blot檢測結(jié)果表明融合蛋白rBPI21-LL37/LL37-rB PI21能被真核細胞A549細胞表達，融合蛋白大小介于25～30 kDa;抑菌試驗進一步驗證此融合蛋白具有抑制細菌生長的生物學效應。
　　2.成功的分離并培養(yǎng)了人臍帶間充質(zhì)干細胞，對其的表面標志鑒定和誘導分化培養(yǎng)都符合相應標準。
　　3.成功的包裝了融合蛋白慢病毒顆粒，應用慢病毒感染完成了對間充質(zhì)干細胞的基因修飾。流式細胞術(shù)顯