逍遙散調(diào)控海馬β-arrestin 2介導(dǎo)的信號通路改善肝郁證的機制研究.pdf

1、背景:
　　肝郁證即肝氣郁結(jié)證，是指肝氣疏泄不及而產(chǎn)生的以氣機郁滯為特點的證候，它屬于中醫(yī)“郁證”的一種證型?！秲?nèi)經(jīng)》中首次提出“郁”的概念，后世醫(yī)家又提出了五郁、六郁學(xué)說。肝郁，則是由五郁、六郁、情志致郁等逐漸演化過來的，將五氣之郁與臟腑之郁聯(lián)系起來。近年臨床流行病學(xué)資料顯示，在五臟病證中，中醫(yī)肝臟病證占總體病證的40％，而肝郁證作為肝臟病證的基本病理變化，可見于臨床各種疾病的初起階段。因此肝郁證一直是近年來中醫(yī)領(lǐng)域研究的熱點。

2、
　　肝郁證的研究分臨床研究和動物實驗研究，在其本質(zhì)研究方面，因許多臨床樣本的不可獲取性，動物研究更具優(yōu)勢。中醫(yī)證候動物模型的建立是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的重要方法。在多種模型復(fù)制方法中，慢性不可預(yù)知溫和刺激法(chronic unexpected mild stress，CUMS)在國內(nèi)外的認(rèn)可度最高，它可以誘導(dǎo)動物的肝郁證表現(xiàn)，其應(yīng)激因子的多樣性、溫和性和不可預(yù)知性很好地模擬了人類肝郁證的病因，且不會造成動物的軀體損害。肝郁證的方證研

3、究也是其本質(zhì)研究的重要方面?！胺綇姆ǔ觯S證立”，辨證論治是中醫(yī)的核心。中醫(yī)證候研究具有以證選方、以方測證、方證互參的特點，通過這一特點，我們可以通過觀察某一證型在相應(yīng)方藥治療前后臨床癥狀的改善來反證辨證的準(zhǔn)確性。近年來對肝郁證本質(zhì)的研究頗多，已初步證實肝郁證具有現(xiàn)代病理生理學(xué)基礎(chǔ)，認(rèn)為肝郁證是在抑郁、焦慮等不良心理應(yīng)激狀態(tài)下，出現(xiàn)高級神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)功能的紊亂，進而影響到神經(jīng)、免疫、消化、運動、感覺等多系統(tǒng)而出現(xiàn)的病理改變和病證表現(xiàn)。近

4、年來對應(yīng)激相關(guān)的下丘腦-垂體-腎上腺素皮質(zhì)系統(tǒng)和海馬突觸可塑性變化的研究較多，說明海馬在肝郁證的發(fā)病中起著重要作用。
　　中醫(yī)證候是疾病發(fā)生和演變的過程中，某一階段中患者機體當(dāng)時所處的特定內(nèi)外環(huán)境的本質(zhì)反映。證候研究是中醫(yī)理論研究的一個關(guān)鍵問題，證候作為一種規(guī)律的病理表現(xiàn)，必然存在其相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，但中醫(yī)證候錯綜復(fù)雜，如何運用現(xiàn)代科學(xué)的方法來揭示其本質(zhì)是其研究的關(guān)鍵點。近年來，一門新興的學(xué)科-蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)為解決這一問題提供了一

5、種新方法。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)表達方式和功能方式的一門學(xué)科，它從整體水平上來認(rèn)識生命現(xiàn)象，與中醫(yī)學(xué)的“整體觀念”類似。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不是一成不變的，蛋白質(zhì)組作為所有蛋白質(zhì)的整合，也是不斷變化的。而中醫(yī)證候在疾病不同階段的病機和表現(xiàn)也是不同的，存在一定的演變規(guī)律，這些變化的物質(zhì)基礎(chǔ)可能就反應(yīng)在蛋白質(zhì)組的水平。將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)證候的研究中，不僅可以反應(yīng)不同癥狀的物質(zhì)基礎(chǔ)，又可以了解不同蛋白質(zhì)組分在證的演變過程中發(fā)生的變異，

6、通過對證候演變前后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究對比來探究中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)變化機制，揭示中醫(yī)證候的內(nèi)涵，可以為中醫(yī)的客觀化道路打下基礎(chǔ)。
　　因此，本研究擬以海馬組織作為切入點，提取其磷酸化蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法進行差異蛋白質(zhì)的鑒定分析。并根據(jù)該蛋白分析結(jié)果的提示，引出肝郁證的關(guān)鍵信號分子及其介導(dǎo)的信號通路，進行更深入的研究。同時選用中醫(yī)經(jīng)典抗肝郁方逍遙散進行干預(yù)，并以臨床經(jīng)典抗抑郁藥氟西?。ㄑ芯勘砻髌淇捎行Ц纳茞瀽灢粯?，興趣減退等肝郁證

7、癥狀）作為陽性對照藥，以期對海馬在肝郁證發(fā)病機制中的作用提供更進一步的證據(jù)，為繼續(xù)深入研究肝郁證的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　目的:
　　采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型，通過觀察模型大鼠的一般狀態(tài)、糖水消耗率及行為學(xué)指標(biāo)等評價模型的成功與否。然后用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對肝郁證模型大鼠海馬磷酸化蛋白質(zhì)進行差異表達分析，并根據(jù)分析結(jié)果的提示引出肝郁證的關(guān)鍵信號分子及其介導(dǎo)的信號通路并進一步研究。試圖借助肝郁證大鼠模型，利用蛋

8、白質(zhì)組學(xué)的方法找到肝郁證相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)，為中醫(yī)證候理論的研究找到相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也可為肝郁證的臨床治療提供新思路，有望發(fā)現(xiàn)其治療的新靶點。并通過逍遙散和氟西汀對模型大鼠進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達水平的差異，探討逍遙散改善肝郁證的作用機理，并利用中醫(yī)證候“以方測證，方證互參”的特點，為肝郁證的本質(zhì)研究及治療提供新思路和新方法。
　　方法:
　　本研究在中醫(yī)證候理論指導(dǎo)下通過CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型，采用中藥復(fù)

9、方逍遙散進行干預(yù)，并應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，以海馬組織為研究對象，找出模型組大鼠與對照組及逍遙散組大鼠海馬組織的差異表達蛋白點，通過鑒定分析并引出肝郁證的關(guān)鍵信號分子及其介導(dǎo)的信號通路，采用免疫組化(Immunohistochemical，IHC)、免疫印跡(Western blot，WB)及熒光定量PCR(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)進一步研究。
　　1、CUMS聯(lián)合孤

10、養(yǎng)的方法復(fù)制肝郁證大鼠模型
　　動物分組及模型復(fù)制:清潔級雄性SD大鼠40只，體重200±20g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機分為對照組、模型組、模型加逍遙散組（簡稱逍遙散組）、模型加氟西汀組（簡稱氟西汀組），每組10只。對照組5只一籠，其余三組單籠飼養(yǎng)，并接受CUMS程序干預(yù)，一周內(nèi)刺激方式隨機使用，連續(xù)三周。
　　藥物干預(yù):逍遙散組給予19 g/kg/d的逍遙散溶液，氟西汀組給予2mg/kg/d的氟西汀混懸液，對照組和模型組均給

11、予蒸餾水，按照10ml/kg灌胃，藥物總量按一日兩次分服。
　　模型評價:通過對大鼠一般狀態(tài)的觀察、糖水消耗率及行為學(xué)檢測等判斷模型的可靠性。
　　2、運用HE染色和尼氏染色，觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)變化。
　　3、海馬磷酸化蛋白質(zhì)的2-DE分離及凝膠圖像
　　優(yōu)化海馬磷酸化蛋白質(zhì)的2-DE分離，對同類混合樣本以組間配對的形式，同時進行2-DE分離，并重復(fù)3次。2-DE分離獲得的凝膠，經(jīng)處理后掃描成圖像。用PDQ

12、uest7.0軟件分析凝膠圖像，獲取每個蛋白質(zhì)的表達量、等電點和分子量等信息。并將組間表達量相差2倍以上的蛋白質(zhì)斑點設(shè)定為差異表達蛋白質(zhì)，由軟件自動生成分析結(jié)果，再結(jié)合人工驗證。
　　4、差異表達蛋白質(zhì)斑點的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫確認(rèn)
　　用結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix assisted laserdesorption time-of-flight mass spectrometry，MALDI-OF-MS

13、)對差異蛋白質(zhì)斑點進行肽質(zhì)量指紋(peptide mass fingerprint，PMF)檢測。根據(jù)http://www.uniprot.org/上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索最終確定結(jié)果蛋白質(zhì)。
　　5、用WB、IHC和酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)等方法檢測海馬中β-arrestin2和CRHR蛋白表達及相關(guān)激素的變化情況。
　　6、用WB和RT-PCR法檢

14、測海馬中β-arrestin2介導(dǎo)的PP2A-Akt-mTOR信號通路的表達情況。
　　7、用WB和IHC法檢測海馬中β-arrestin2介導(dǎo)的ERK-BDNF信號通路的表達情況。
　　8、統(tǒng)計學(xué)方法
　　實驗結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）的形式表示，SPSS13.0軟件統(tǒng)計包用于數(shù)據(jù)處理。大鼠每周的體重情況采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，其余的指標(biāo)，多樣本的均數(shù)比較均采用單因素方差分析，若方差齊，多重比較采用LSD

15、法檢驗，若方差不齊，則采用Welch分析，多重比較采用Games-Howell法檢驗。同組動物造模前后的均數(shù)比較采用配對樣本的t檢驗。所有的檢驗方法均以P＜0.05作為具有顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1、采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的方法成功復(fù)制了肝郁證大鼠模型。造模3周后，從一般狀態(tài)來看，造模初期，模型組大鼠表現(xiàn)為焦慮、煩躁、掙扎，隨后逐漸麻木，出現(xiàn)行動遲緩、躲在角落、食欲減退、皮毛無光澤、便溏等肝郁證表現(xiàn)。逍遙散組和氟西汀組上

16、述表現(xiàn)較輕，且各種癥狀的發(fā)展變化相對緩慢。對照組則一直活潑好動，未見異常行為狀態(tài)。各組間體重增長具有顯著性差異，模型組體重最低，逍遙散組和氟西汀組體重則高于模型組，而對照組大鼠體重則一直處于穩(wěn)步增長中，體重最高。
　　2、HE染色發(fā)現(xiàn)模型組神經(jīng)元縮小，細(xì)胞形態(tài)改變?yōu)椴灰?guī)則形，逍遙散組和氟西汀組神經(jīng)元改變則較模型組改善，尼氏染色發(fā)現(xiàn)模型組尼氏體數(shù)量減少，而逍遙散組和氟西汀組的尼氏體數(shù)量則較模型組增加。
　　3、獲得了高質(zhì)量的海

17、馬組織磷酸化蛋白質(zhì)的2-DE圖像，發(fā)現(xiàn)了10個肝郁證大鼠的差異蛋白，其中2個在模型組表達下調(diào)，8個表達上調(diào)，并鑒定出了蛋白的相關(guān)信息。
　　結(jié)論:
　　通過對CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)復(fù)制的肝郁證大鼠模型海馬組織磷酸化蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了10個肝郁證大鼠的差異蛋白并鑒定出了蛋白的相關(guān)信息。并根據(jù)差異蛋白分析結(jié)果引出了肝郁證的關(guān)鍵信號分子β-arrestin2，并研究了CRHR表達與相關(guān)激素的變化情況，以及其介導(dǎo)的PP2A-A

18、kt-mTOR和ERK-BDNF信號通路。結(jié)果提示β-arrestin2通過對CRHR2表達及Urocortin-2、CORT濃度的影響，及介導(dǎo)PP2A-Akt-mTOR、ERK-BDNF信號通路改變引起大鼠海馬突觸可塑性的改變，導(dǎo)致肝郁證。而逍遙散可以通過調(diào)控海馬β-arrestin2介導(dǎo)的信號通路來改善肝郁證。本研究以前期蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果作為切入點，提出β-arrestin2是介導(dǎo)PP2A-Akt-mTOR、ERK-BDNF信號通路、